Bioethanol production from edible insect excreta: a case study on frass from house crickets
可食用昆虫粪便制备生物乙醇——家蟋蟀粪便案例研究
期刊《Biofuel Research Journal》2024年第44卷，页码2211-2224，DOI：10.18331/BRJ2024.11.4.2，2024年12月1日在线发表
1 摘要总结
现有生物乙醇原料多存在与人争粮问题，家蟋蟀养殖产生大量粪便（虫粪）木质纤维素废弃物，是极具潜力二代非粮原料。本文首次系统探究家蟋蟀虫粪水解发酵生产生物乙醇整套工艺，对比热、酸、碱单一/复合预处理搭配纤维素酶、蛋白酶的糖化效果，筛选多株自然分离酵母开展发酵验证；实验证实热-稀硫酸复合纤维素酶预处理可获得最高可溶性糖（37.03 g/L），蛋白酶处理游离氨基氮含量最优；纯虫水解液发酵乙醇达10.53 g/L，添加高浓度甜菜糖蜜后乙醇提升至30.57 g/L，糖利用率超88%。生命周期LCA表明纯虫粪发酵环境负荷更低，但生产成本偏高；技术经济分析显示虫粪+高糖蜜组合兼顾产能与经济性，证明家蟋蟀粪便可作为可持续非粮原料用于工业化生物乙醇制备，为昆虫养殖废弃物循环利用提供全新路径。
2 中文关键词
家蟋蟀，虫粪，木质纤维素，预处理，水解，酿酒酵母，生物乙醇，生命周期评价，技术经济分析
3 研究目的
1. 系统评价热、酸碱、酶解多种预处理方式对家蟋蟀虫粪糖化产糖、游离蛋白的影响，确定最优水解组合工艺；
2. 筛选多株天然酵母，验证虫粪水解液单独、复配甜菜糖蜜两种基质的发酵适配性；
3. 定量不同发酵体系糖消耗速率、乙醇产率，利用修正Gompertz模型拟合发酵动力学参数；
4. 通过生命周期评估（LCA）对比纯虫粪、糖蜜、混合底物生产乙醇的环境影响差异；
5. 开展技术经济分析，评估各工艺生产成本，明确工业化最优底物组合；
6. 建立昆虫养殖废弃物高值化转化生物乙醇完整技术方案，填补虫粪制乙醇研究空白。
4 研究思路
1. 原料表征：测定家蟋蟀干虫粪粗纤维、半纤维素、木质素、粗蛋白组分（表S1）；
2. 分组水解实验：设置仅热处理、热+纤维素酶、热稀酸+纤维素酶、热碱+纤维素酶、热+蛋白酶五组预处理，苯酚硫酸法测总糖、茚三酮法测游离氨基氮（图2）；
3. 酵母分离鉴定：从厨余、虫粪、甜菜汁等分离酵母，MALDI-ToF质谱鉴定菌株（表2）；
4. Bioscreen高通量酵母生长测试：不同水解液（有无糖蜜）监测24 h菌体生长OD动态（图S1–S10）；
5. 48 h分批摇瓶发酵：分纯虫水解液、低/高糖蜜、虫粪复配低/高糖蜜五组，定时HPLC检测葡萄糖、二糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇（图3、4、5）；
6. 动力学拟合：采用修正Gompertz模型计算最大乙醇浓度、产率、迟滞期（表5）；
7. LCA生命周期建模：以1 kg乙醇为功能单元，测算各工艺水电、化学品、能耗环境排放（表S2、图S11）；
8. 技术经济核算：对比五种底物乙醇生产成本（图8），综合环境、产能、成本筛选最优工艺；
9. 整合糖化、发酵、环境、经济数据总结整套虫粪制乙醇工艺优缺点，提出优化方向。
5 研究亮点
1. 全球首项以家蟋蟀虫粪为唯一木质纤维素原料制备生物乙醇的完整研究，开辟昆虫养殖废弃物资源化新方向；
2. 证实稀硫酸热处理联合纤维素酶是虫粪最优糖化工艺，可溶性糖产量远超单一热、碱、蛋白酶处理；
3. 虫粪水解液搭配甜菜糖蜜可大幅提升乙醇终浓度至30.57 g/L，糖转化效率接近工业糖蜜发酵水平；
4. 高通量Bioscreen筛选发现虫粪原生光滑念珠菌生长速度最优，但出于生物安全选用酿酒酵母开展正式发酵；
5. 同步耦合生命周期环境评估与技术经济测算，兼顾环保性与工业化落地可行性；
6. 明确虫粪水解液仅阿拉伯糖无法被酵母利用，其余六碳、五碳混合糖均可高效消耗。
6 可延伸的研究方向
1. 同步糖化发酵（SSF）工艺优化，省去单独水解步骤、降低能耗；
2. 筛选可利用阿拉伯基因工程酵母，进一步提升总糖转化率；
3. 复合酶复配（木聚糖酶+纤维酶）进一步提升虫粪糖化效率；
4. 中试发酵罐放大实验，验证实验室工艺规模化稳定性；
5. 混合多种昆虫粪便（黑水虻、黄粉虫）开展对比糖化发酵；
6. 开发低成本复合预处理，减少硫酸、外源酶使用，降低生产与环境成本。
7 测量数据、对应图表与研究意义
1. 虫粪基础组分检测数据（表S1）：明确原料木质纤维素与蛋白占比，为预处理酶添加量、酸碱用量提供定量依据；
2. 不同预处理水解糖、FAN柱状图（图2）：直观证明热-稀硫酸+纤维素酶复合处理产糖最高，蛋白酶仅提升游离蛋白，筛选最优糖化工艺；
3. Bioscreen酵母生长时序OD曲线（图S1–S10）：高通量批量对比7株酵母在10种水解基质生长快慢，快速筛选适配发酵菌株，消除摇瓶分批实验误差；
4. 发酵全程总糖、单糖消耗曲线（图3、4）：量化葡萄糖、二糖、木糖消耗速率，证实阿拉伯糖不可发酵，明确底物碳源利用限制；
5. 各组乙醇生成动力学曲线（图5、表4、5）：修正Gompertz模型拟合最大产醇速率、迟滞期，定量糖蜜增效幅度，为发酵时长、接种量优化提供参数；
6. LCA环境损伤评估柱状图（图S11）：纯虫粪乙醇对人类健康、生态系统环境负担最低，但资源消耗偏高；
7. 乙醇生产成本柱状图（图8）：虫粪+高糖蜜组合平衡产能与生产成本，是工业化最优方案；
8. 工艺物料能量流程图（图1）：完整梳理虫粪收集、预处理、水解、发酵全流程物料与能量输入输出，支撑技术经济核算。
8 整体研究结论
1. 家蟋蟀虫粪富含纤维素、半纤维素，是优良非粮木质纤维素生物乙醇原料，单一热处理糖化效率极低；
2. 121℃热预处理+1%稀硫酸+10%纤维素酶是最优糖化方案，水解液总糖可达37.03 g/L；蛋白酶仅提升游离氨基氮，对产糖无显著增益；
3. 多株酵母均可在虫粪水解液生长，虫粪来源光滑念珠菌增殖最快，但考虑致病性选用标准酿酒酵母发酵；
4. 纯虫粪水解液48 h发酵乙醇10.53 g/L；添加60 g/L甜菜糖蜜后乙醇提升至30.57 g，总糖消耗率88.97%；阿拉伯糖无法被酿酒酵母代谢；
5. 生命周期评价显示纯虫发酵环境影响最低，但乙醇产量低、单位生产成本最高；虫粪复配高糖蜜体系产能高、蒸馏能耗最低，综合经济效益最优；
6. 现有工艺存在短板：虫粪批次组分波动、预处理抑制剂未评估、仅实验室小试，后续需工艺放大与酶配方优化；
7. 家蟋蟀虫粪可作为可持续二代生物乙醇原料，实现食用昆虫养殖废弃物闭环循环，契合循环经济与清洁能源发展需求。
9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义
本研究全程使用Bioscreen C高通量微生物检测仪完成7株酵母在10种不同虫粪水解基质的24 h连续生长监测，核心研究价值：
1. 高通量96孔同步并行检测，一次性完成所有预处理、有无糖蜜组合实验组，省去多批次摇瓶重复操作，大幅缩短菌株筛选周期；
2. 每5 min自动采集420–580 nm OD时序数据，完整捕捉延迟期、对数期、稳定期生长动态，仅终点平板无法区分生长快慢差异；
3. 恒温持续振荡封闭培养，统一温度、接种量、培养基，消除人工取样、温度波动带来系统误差，菌株生长对比数据统计学可信度更高；
4. 直观区分不同水解基质对酵母促生长效果：仅热处理无酶水解液几乎无法支撑酵母增殖，添加纤维素酶后菌体OD显著提升，验证预处理糖化效果；
5. 同步对比光滑念珠菌、酿酒酵母等生长曲线，客观判定原生虫粪酵母生长优势，为正式发酵菌株选择提供定量表型依据；
6. 生长OD数据与后续48 h摇瓶乙醇产率相互印证，建立“水解糖含量-酵母增殖-乙醇产量”完整证据链，支撑预处理工艺筛选结论；
7. 可直观观察糖蜜添加对所有菌株生长的协同促进作用，解释高糖蜜组乙醇产量大幅提升的底层生理原因。