全自动生长曲线分析仪

Sse1, Hsp110 chaperone of yeast, controls the cellular fate during endoplasmic reticulum stress

酵母Hsp110分子伴侣Sse1调控内质网应激下细胞命运

期刊G3: Genes, Genomes, Genetics，2024年第14卷第6篇，DOI:10.1093/g3journal/jkae075，牛津大学出版社，2024年4月在线发表，开放获取CC BY论文

1 摘要总结

Sse1是酿酒酵母胞质Hsp110分子伴侣，已知具备Hsp70核苷酸交换因子、蛋白解聚、翻译偶联分子伴侣多重功能。本研究揭示Sse1参与内质网蛋白稳态调控，与内质网未折叠蛋白应答（ER-UPR）通路核心基因IRE1、HAC1存在遗传互作；衣霉素诱导内质网应激时，sse1敲除菌株（sse1Δ）表现出独特应激耐受，该表型完全依赖完整Ire1-Hac1信号通路。缺失Sse1会破坏内质网应激后多聚核糖体向单核糖体的重排过程，应激下翻译持续进行；sse1Δ菌株ER-UPR激活更快、稳态恢复速度显著快于野生型，且可逃逸内质网应激引发的细胞周期停滞，短期、长期衣霉素处理后细胞存活率均大幅高于野生酵母。研究证实胞质分子伴侣Sse1是内质网应激响应关键调控因子，可决定严重内质网压力下细胞分裂与存活命运。

2 中文关键词

分子伴侣，Hsp110，Sse1，内质网应激，未折叠蛋白应答，细胞周期，蛋白翻译

3 研究目的

1. 探究胞质分子伴侣Sse1是否参与酵母内质网应激调控，明确其与ER-UPR通路Ire1、Hac1的遗传关联；

2. 解析sse1缺失菌株对衣霉素内质网应激产生耐受的分子基础，排除热休克应答（HSR）等干扰因素；

3. 阐明Sse1如何调控内质网应激下核糖体重构与全局蛋白翻译动力学；

4. 对比野生型与sse1Δ菌株ER-UPR激活、消退时序差异，解析Sse1对应激应答时长的调控作用；

5. 揭示Sse1介导内质网应激诱导的细胞周期阻滞、细胞死亡通路，阐明其决定细胞命运的功能；

6. 结合转录组、蛋白组、流式、共聚焦多组学数据，建立Sse1调控内质网应激完整作用模型。

4 研究思路

1. 菌株构建：构建野生型、sse1Δ、sse2Δ、ire1Δ、hac1Δ及双敲除菌株，配套Sse1回补、突变体过表达质粒（图1、图2）；

2. 梯度衣霉素平板稀释生长实验，结合Bioscreen液体生长曲线定量菌株应激存活能力，验证sse1Δ特异性衣霉素抗性（图1ai-av）；

3. HAC1 mRNA可变剪接、Kar2蛋白免疫印迹，验证衣霉素成功激活ER-UPR（图1bi-cii）；

4. 遗传互作验证：构建ire1Δ-sse1Δ、hac1Δ-sse1Δ双敲株，证明sse1Δ抗性依赖完整Ire1-HAC1通路（图2a-c）；

5. 排除HSR干扰：过表达持续激活Hsf1热休克因子、其他CLIPS家族敲除株对照，证明耐受表型不依赖基础热休克响应（图2d-e）；

6. 多聚核糖体图谱分析，对比应激前后多聚/单核糖体比例，明确Sse1调控核糖体重排（图3a）；

7. Click化学标记新生蛋白、UPRE-GFP流式检测，量化全局及UPR靶基因翻译速率（图3b-e、图4a-e）；

8. RNA-seq转录组、标记定量蛋白组，对比野生与sse1Δ应激前后通路富集差异（图5、图6）；

9. 共聚焦细胞形态、流式细胞周期/PI死亡染色，分析Sse1对应激下细胞分裂、存活的调控（图7a-h）；

10 整合全部生化、组学、细胞表型数据，绘制Sse1调控内质网应激分子模型（图8）。

5 研究亮点

1. 首次发现胞质Hsp110伴侣Sse1跨细胞器调控内质网未折叠蛋白应答，建立胞质分子伴侣与ER-UPR的遗传互作关系；

2. 发现sse1敲除株特异性耐受衣霉素内质网应激，该表型不依赖热休克通路，由翻译相关CLIPS功能缺失介导；

3. 阐明Sse1核心功能：内质网应激时驱动多聚核糖体解离为单核糖体，抑制全局蛋白翻译、延长ER-UPR持续激活时间；

4. 证实Sse1是内质网应激诱导细胞周期停滞、细胞死亡的必要调控蛋白，缺失后细胞可绕过分裂阻滞、大幅提升存活率；

5. 结合转录组、蛋白组、核糖体图谱、活细胞动态检测多维度证据，完整构建Sse1控制应激细胞命运调控通路。

6 可延伸的研究方向

1. 体外生化实验解析Sse1与Ire1/Hac1蛋白直接互作分子结构；

2. 明确Sse1调控核糖体重构的蛋白互作靶点，解析翻译抑制分子机制；

3. 探究Slt2 MAPK通路与Sse1协同调控细胞周期的上下游关系；

4. 在哺乳动物细胞验证Hsp110同源蛋白是否保守调控内质网应激与细胞凋亡；

5. 筛选靶向Hsp110小分子，调控肿瘤内质网应激介导的细胞死亡；

6. 探究Jjj1、Gim2等CLIPS伴侣与Sse1并行调控内质网应激的分工机制。

7 测量数据、对应图表与研究意义

1. Bioscreen高通量酵母生长曲线、平板斑点定量（图1ai-av、图2）：量化各菌株衣霉素应激生长差异，直观证明仅sse1缺失产生特异性耐受，同时验证回补、双敲株表型，锁定ER-UPR通路是抗性必要条件；

2. HAC1剪接电泳、Kar2免疫印迹定量（图1b-c）：证明衣霉素有效激活UPR，sse1Δ菌株UPR基础水平更高；

3. 多聚核糖体蔗糖梯度图谱（图3a）：直接证明Sse1缺失阻碍应激下多聚核糖体解离，维持持续蛋白翻译；

4. Click新生蛋白荧光、UPRE-GFP流式时序数据（图3、图4）：定量UPR激活与消退动力学，sse1Δ应答启动更快、解除更快；

5. 转录组通路富集气泡图、蛋白组火山图（图5、图6）：全局层面证实sse1Δ应激时翻译、细胞周期通路特异性上调；

6. 共聚焦细胞形态、细胞周期流式、PI死亡率检测（图7）：可视化定量Sse1缺失可解除内质网应激带来的分裂阻滞、降低细胞死亡；

7. 机制总结示意图（图8）：整合所有实验，清晰对比野生与sse1Δ内质网应激全过程细胞应答差异。

8 整体研究结论

1. 酵母胞质分子伴侣Sse1与ER-UPR核心基因IRE1、HAC1存在负遗传互作，是内质网蛋白稳态关键调控因子；

2. sse1基因缺失菌株仅在可充分激活ER-UPR浓度的衣霉素处理下产生应激耐受，该表型不依赖热休克响应，由CLIPS翻译调控功能缺失导致；

3. 内质网应激条件下，Sse1介导多聚核糖体向单核糖体重排，抑制全局蛋白合成，延长UPR持续激活状态；sse1Δ核糖体重排受阻，新生蛋白持续合成，UPR快速激活并快速回落，更快恢复细胞稳态；

4. Sse1是衣霉素诱导内质网应激后细胞周期停滞、细胞死亡的必需蛋白；sse1Δ可绕过分裂阻滞，长期应激下细胞存活率显著高于野生酵母；

5. 内质网应激时，Sse1通过调控翻译重编程、细胞周期检查点双重途径决定细胞存活或死亡命运；

6. Jjj1、Gim2等其他CLIPS伴侣缺失可产生类似衣霉素耐受，与Sse1存在遗传上位互作，共同参与内质网应激调控网络。

9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义

本研究采用Bioscreen全自动微生物检测仪持续监测酵母液体生长动态，用于定量衣霉素等多种胁迫下菌株增殖能力，核心研究价值：

1. 实现高通量多菌株、多药物浓度平行培养，统一温度、振荡条件，消除平板斑点实验仅终点定性的局限，可连续记录延迟期、对数期、稳定期完整生长动态（图1aii、aiv）；

2. 精准量化sse1Δ、sse2Δ、野生株在有无衣霉素下的生长速率、最大生物量差异，数值化证明sse1缺失带来的应激生存优势，区分轻微生长差异；

3. 配套空载体、Sse1野生型/突变体回补菌株同步检测，定量回补后表型恢复程度，直接佐证Sse1基因是衣霉素耐受的决定性基因；

4. 区分30℃常温、37℃热激、梯度衣霉素多种胁迫下菌株生长表型，明确sse1的保护作用仅特异性针对内质网应激，热激等其他胁迫无优势；

5. 标准化重复体系，生物学重复曲线误差小，统计学差异可信度高，为遗传互作、基因功能判定提供定量生理表型基线；

6. 生长曲线表型与核糖体图谱、流式细胞、组学数据相互印证，搭建“分子伴侣-翻译调控-应激应答-细胞存活”完整证据链，支撑Sse1调控细胞命运的核心结论。