Exploring the Antifungal Activity of Various Natural Extracts in a Sustainable Saccharomyces cerevisiae Model Using Cell Viability, Spot Assay, and Turbidometric Microbial Assays
利用细胞存活率、斑点测定、比浊微生物法探究多种天然提取物在可持续酿酒酵母模型中的抗真菌活性
期刊《Applied Sciences》2024年第14卷第5期，文章编号1899，DOI：10.3390/app1405189，2024年2月26日在线发表，MDPI开源CC BY论文
1 摘要总结
天然植物提取物是食品工业绿色防腐添加剂重要候选原料。本研究选用酿酒酵母工业菌株（葡萄酒酵母、啤酒酵母、面包酵母）作为真核微生物评价模型，评估贯叶连翘、希俄斯乳香、迷迭香三种商用植物提取物的抗酵母活性；采用纸片扩散法、斑点成像定量实验、Bioscreen比浊生长曲线三种检测方法并行验证，并通过LC-MS鉴定提取物多酚组分。纸片扩散实验仅迷迭香提取物对全部酵母产生抑菌圈；斑点实验中三种提取物与载体油均表现微弱抑制；高通量生长曲线检测显示三种提取物均可显著降低酵母最大生长速率，载体油无抑制效果。同时发现啤酒、面包酵母对伊曲康唑存在耐药性；LC-MS证实三种提取物均富含黄酮、酚酸等多酚类物质，推测多酚是抗真菌核心活性成分。研究表明单一抑菌检测方法存在局限性，需多方法联合评估天然提取物抑菌潜力，该类提取物可作为复合天然食品防腐剂，用于抑制食品腐败酵母。
2 中文关键词
酿酒酵母，天然植物提取物，抗真菌活性，迷迭香，贯叶连翘，希俄斯乳香，食品防腐剂，高通量生长曲线测定
3 研究目的
1. 构建葡萄酒、啤酒、面包三类工业酿酒酵母综合评价模型，对比不同商用植物提取物抗酵母能力；
2. 对比纸片扩散、斑点定量、Bioscreen生长曲线三种微生物抑菌检测方法的优缺点与适用场景；
3. 明确载体油（葵花油、辛酸甘油三酯）自身是否存在抗酵母干扰活性；
4. 测试6种医用抗真菌药对三类工业酵母的抑菌差异，验证工业酵母耐药现象；
5. LC-MS解析三种提取物多酚化学组成，关联多酚组分与抗真菌活性；
6. 评估该系列植物提取物作为天然食品防腐添加剂的应用可行性。
4 研究思路
1. 菌种与试剂准备：获取葡萄酒、啤酒、面包商用酿酒酵母；采购希腊本土有机贯叶连翘、希俄斯乳香、迷迭香商用提取物；
2. 纸片扩散实验：酵母菌悬液涂布平板，纸片加载提取物/6种医用抗真菌药，37℃培养48h测量抑菌圈直径（图1）；
3. 斑点定量实验：梯度稀释酵母菌液，添加提取物/载体油，点板培养后图像灰度定量菌落生长量（图2）；
4. Bioscreen高通量比浊实验：30℃、37℃双温度，每30min采集OD600连续48h，拟合生长动力学参数（图3、补充图S3）；
5. LC-MS液质联用：定性鉴定提取物内酚酸、黄酮、单宁类多酚化合物（表1）；
6. 统计学分析：单因素方差分析+邓肯多重比较，p<0.05判定差异显著；
7. 整合三类抑菌数据、多酚鉴定结果，分析检测方法差异与提取物防腐应用价值。
5 研究亮点
1. 首次采用三类工业酿酒酵母作为复合真核模型，系统对比三种希腊特色药用植物提取物抗腐败酵母活性；
2. 证实三种主流抑菌检测方法结果存在显著差异，纸片法灵敏度最低，Bioscreen高通量生长曲线可定量生长速率细微抑制，是最优定量评价手段；
3. 发现啤酒、面包工业酵母对伊曲康唑天然耐药，证明工业长期胁迫会诱导酵母抗唑类药物表型；
4. 区分提取物活性与载体油干扰效应：琼脂静态体系载体油有微弱抑制，液体培养体系无抑菌作用；
5. LC-MS完整解析三类提取物多酚特征，明确乳香酚酸种类最丰富，建立多酚含量与抗酵母活性关联；
6. 提出天然提取物复配化学防腐剂的食品保鲜新思路，降低合成防腐剂量。
6 可延伸的研究方向
1. 分离提取物单一纯多酚单体，明确每种组分单独抗酵母作用与协同效应；
2. 开展液体食品、焙烤、酒类实际保鲜应用实验，验证提取物防腐实操效果；
3. 扩大测试腐败酵母菌株（假丝酵母、接合酵母、红酵母等），拓宽抑菌谱评价；
4. 解析多酚破坏酵母细胞膜、抑制增殖的分子作用机制；
5. 优化提取工艺，提高活性多酚得率，降低商用生产成本；
6. 开展细胞毒理实验，评估提取物食品添加安全剂量。
7 测量数据、对应图表与研究意义
1. 纸片扩散抑菌圈直径柱状图（图1）：直观对比三种提取物、六种医用抗真菌药抑菌能力，仅迷迭香可形成稳定抑菌圈，快速初筛提取物抑菌潜力；
2. 斑点实验菌落灰度定量图（图2）：静态琼脂体系下载体油存在轻微抑菌干扰，区分固液培养体系检测偏差；
3. Bioscreen酵母时序生长曲线、生长速率柱状图（图3、补充图S3）：30/37℃两组温度定量酵母迟滞期、最大生长速率变化，精准证明三种提取物均可显著抑制酵母增殖，载体油无作用，是定量抑菌核心数据；
4. LC-MS多酚定性数据表（表1）：明确三类提取物共有黄酮、酚酸类活性物质，乳香多酚种类最丰富，解释提取物抑菌物质基础；
5. 补充附图S1-S3：医用抗真菌药梯度抑菌、30℃生长对照，完善温度、药物对照数据，支撑酵母耐药结论。
8 整体研究结论
1. 三种商用天然植物提取物均含大量多酚类活性物质，具备抑制工业酿酒酵母的潜力，但不同检测方法结果差异极大；
2. 纸片扩散法仅迷迭香提取物可检出抑菌效果，斑点实验提取物与载体油均微弱抑制，Bioscreen液体生长曲线可定量捕捉全部提取物的生长抑制作用，多方法联合评估必不可少；
3. 辛酸甘油三酯、葵花油两种载体油仅在静态琼脂斑点实验产生轻微干扰，液体发酵体系无抗酵母活性，不会干扰液体食品抑菌评价；
4. 葡萄酒酵母对6种医用抗真菌药均敏感，啤酒、面包酵母对伊曲康唑产生耐药，工业环境长期胁迫可诱导酵母唑类抗性；
5. 迷迭香、贯叶连翘、希俄斯乳香提取物均可延缓酵母生长，适合作为天然复配防腐剂，减少食品化学防腐剂使用；
6. 本研究仅针对酿酒酵母，后续需拓展多种食品腐败酵母验证广谱抑菌效果。
9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义
本研究采用Bioscreen C 100孔蜂巢板全自动比浊检测仪，30℃、37℃双温度持续48h每30min自动检测OD600，全程自动振荡，用于定量酵母生长动力学，核心研究价值：
1. 实现高通量平行对照：一次性同步空白、三种提取物、两种载体油多组样品，统一接种量、温度、培养基，消除分批摇瓶人工操作误差；
2. 动态全程定量，区别终点定性实验：纸片、斑点仅终点观测，Bioscreen完整记录迟滞期、对数期、稳定期，通过最大生长速率μmax量化微弱抑菌效果，检出纸片法无法识别的贯叶连翘、乳香抑制作用；
3. 双温度梯度模拟食品常温、发酵高温两种储存场景，明确温度不改变提取物抑菌趋势，提升数据工业参考价值；
4. 精准区分载体油干扰：液体悬浮培养条件下载体油无显著抑制，排除斑点琼脂体系油脂扩散带来的假阳性抑菌结果；
5. 配套ComBase动力学模型拟合，将OD时序数据转化标准化生长参数，实现各组抑菌程度统计学定量对比；
6. 生长曲线定量数据与纸片、斑点定性结果形成互补证据链，完整证明单一抑菌检测方法存在局限性，确立高通量生长曲线作为天然提取物抑菌标准定量手段。