Discovery of novel secondary metabolites from the basidiomycete Lentinus cf. sajor-caju and their inhibitory effects on Staphylococcus aureus biofilms
担子菌近香侧耳新型次级代谢物及其对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制活性研究
来源：期刊：Fitoterapia，2024年第175卷，文章编号105904；DOI：10.1016/j.fitote.2024.105904；
1 摘要总结
本研究从肯尼亚热带雨林分离的担子菌近香侧耳（Lentinus cf. sajor-caju）液体发酵提取物中分离鉴定3种全新微孔酸衍生物：微孔酸H、I、J（MAH、MAI、MAJ）。通过高分辨质谱、一维/二维核磁共振波谱完成全部化合物结构解析；结晶紫染色、XTT代谢活性检测、激光共聚焦显微成像等生物膜实验证实，微孔酸H与I具备金黄色葡萄球菌生物膜抑制活性，且发挥作用的药物浓度不会抑制浮游细菌正常生长；微孔酸I联用万古霉素、庆大霉素时可显著提升两种抗生素抗生物膜效果，微孔酸J无明显抑膜活性。该研究为真菌来源低毒抗生物膜先导化合物提供新资源，也为金黄色葡萄球菌生物膜相关感染联合给药方案提供新思路。
2 中文关键词
金黄色葡萄球菌，生物膜，次级代谢产物，担子菌，生物膜抑制剂
3 研究目的
1. 从肯尼亚野生近香侧耳发酵液中分离纯化新型次级代谢产物，解析3种微孔酸完整化学结构；
2. 评价3种微孔对各类致病菌、真菌的抑菌能力，同时检测化合物对哺乳动物细胞的毒性；
3. 系统评估微孔H、I、J抑制金黄色葡萄球菌生物膜的效果，明确其是否干扰浮游细菌增殖；
4. 探究微孔类物质与万古霉素、庆大霉素、利福平联用的协同抗生物膜作用；
5. 初步分析化合物侧链结构与抑膜活性的构效关系，筛选低毒抗生物膜先导分子。
4 研究思路
1. 菌株鉴定：采用ITS、LSU、RPB2多基因测序结合形态观察，将真菌菌株MUCL 55566鉴定为近香侧耳近缘种；
2. 大规模液体发酵，分别对菌丝体、发酵上清液进行有机溶剂萃取，XAD树脂富集粗提物，制备型反相HPLC分段纯化得到3种单体；
3. 理化表征与波谱解析：测定旋光、紫外吸收，结合HR-ESIMS、¹H/¹³C、HSQC、HMBC、ROESY多维核磁数据，解析MAH、MAI、MAJ完整骨架与立体构型（表1、图1、图2）；
4. 基础活性筛选：微量肉汤稀释法测定各类微生物MIC，MTT法检测化合物对KB-3-1、L929细胞毒性；
5. 单一组分抗生物膜活性评价：结晶紫染色定量抑膜率（图3A）、XTT试剂检测膜内菌体代谢活力（图3B）、激光共聚焦显微镜直观观测生物膜三维结构与活菌分布（图3C）；
6. 浮游菌生长检测：使用Bioscreen C高通量仪器记录不同药物浓度下金葡菌完整生长曲线（图4），区分抑膜与抑菌两种作用；
7. 联合药效评价：棋盘稀释法测定FIC指数，CFU菌落计数定量联用后生物膜活菌数量变化（图5）；
8. 纤维蛋白原结合实验，初步探索化合物抑制细菌黏附的作用靶点；
9. 整合结构、活性数据，总结侧链亲脂性对抑膜活性的构效规律。
5 研究亮点
1. 首次从近香侧耳中分离得到3种全新微孔酸类二萜次级代谢产物，扩充多孔菌天然产物资源库；
2. MAH、MAI可选择性抑制生物膜，有效作用浓度下不影响浮游金葡菌生长，同时无哺乳动物细胞毒性，安全性优于已知微孔酸A；
3. 证实MAI与万古霉素、庆大霉素存在协同抗生物膜效果，具备临床抗感染联合用药开发潜力；
4. 明确构效规律：分子侧链亲脂性越强抑膜活性越高，内酯环结构会完全丧失抑制能力，为分子改造提供理论支撑；
5. 综合生长曲线、定量染色、共聚焦成像、活菌计数多维度实验，完整验证化合物抗生物膜功能，实验体系标准化、数据可靠。
6 可延伸的研究方向
1. 体外分子互作实验，明确微孔酸靶向金葡菌何种黏附蛋白，阐明分子作用机制；
2. 对化合物侧链进行化学修饰，提升亲脂性，优化抑膜活性并维持低细胞毒性；
3. 构建医疗器械植入小鼠生物膜感染模型，验证化合物体内联合抗生素治疗效果；
4. 扩大近香侧耳及近缘真菌筛选范围，挖掘高活性微孔类似物；
5. 转录组测序对比给药前后金葡菌基因表达变化，解析生物膜调控通路；
6. 将化合物开发为医用材料涂层，预防器械相关生物膜感染。
7 测量数据、对应图表与研究意义
1. 核磁、高分辨质谱、旋光紫外波谱数据（表1、图1、图2）：确定MAH、MAI、MAJ为全新天然产物，对比微孔酸A明确结构差异，是构效分析的化学基础；
2. Bioscreen C浮游菌生长曲线（图4A/B/C）：定量不同药物浓度对金葡菌增殖的影响，直观区分“仅抑制生物膜、不杀伤浮游菌”的选择性优势；
3. 结晶紫抑膜定量柱状图（图3A）：量化梯度浓度下生物膜抑制百分比，确定有效给药浓度区间；
4. XTT代谢活性检测结果（图3B）：与结晶紫数据相互印证，证明化合物可降低生物膜内菌体代谢水平；
5. 激光共聚焦显微图像（图3C）：直观呈现给药后生物膜变薄、死菌增多的形态变化，可视化验证抑膜效果；
6. 联用后CFU活菌计数图（图5A/B）：定量MAI与抗生素协同清除生物膜的增效作用；
7. HMBC、ROESY核磁关联图谱（图2）：支撑3个新化合物的碳骨架、双键与立体构型判定。
8 整体研究结论
1. 从近香侧耳发酵体系分离出3种未报道的异柠檬酸二萜醚类新化合物MAH、MAI、MAJ；
2. MAH、MAI无广谱杀菌活性，对哺乳动物细胞无毒，可选择性抑制金黄色葡萄球菌生物膜，MAJ无抑膜活性；
3. MAH、MAI发挥抑膜作用的浓度不会阻碍浮游金葡菌增殖，拥有区别于传统抑菌药物的独特优势；
4. 构效关系显示分子侧链亲脂性和抑膜活性正相关，内酯环结构会彻底消除生物膜抑制能力；
5. MAI与万古霉素、庆大霉素联用可显著降低生物膜内活菌载量，存在协同抗感染效果；
6. 近香侧耳来源微孔酸可作为低毒先导分子，用于开发医疗器械防膜制剂或抗生素辅助增效药物。
9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义
本研究采用芬兰Bioscreen C全自动高通量微生物检测仪，每60 min自动采集490–580 nm吸光度，持续监测不同梯度MAH、MAI、阳性对照处理下金葡菌完整生长周期（图4），具体研究意义：
1. 区分两类抗菌作用模式：多数抗膜物质会同时抑制浮游菌，本仪器长时序生长曲线直观证明3.9–62.5 μg/mL范围内MAH、MAI仅阻断菌体黏附成膜，不影响浮游细菌增殖，筛选出选择性先导物；
2. 精准划定安全给药阈值：同步设置多组浓度梯度，定量确定不产生浮游菌毒性的有效作用区间，为后续生物膜、细胞毒性实验统一给药浓度；
3. 对比新旧化合物安全性差异：阳性对照MAA低浓度即可延缓菌体生长，MAH、MAI无生长抑制作用，凸显新型天然产物的安全优势；
4. 高通量平行体系降低实验误差：蜂巢96孔板可同时完成多梯度、多重生物学重复，全程恒温连续振荡，无需人工间断取样，时序OD数据连续完整，能捕捉延迟期、对数期细微生理变化；
5. 完善实验证据链：生长曲线排除“生物膜变薄是因为菌体增殖被抑制”的干扰因素，直接证明化合物特异性阻断生物膜组装，夯实作用机制结论；
6. 统一标准化培养条件，所有实验组数据可横向对比，可靠支撑构效关系、联合用药效果分析。