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TbsP and TrmB jointly regulate gapII to influence cell development phenotypes in the archaeon Haloferax volcanii

TbsP与TrmB共同调控gapII，影响古菌沃氏盐古菌的细胞发育表型

来源:期刊：Molecular Microbiology，出版方：WILEY，2024年，第121卷，页码742–766；DOI：10.1111/mmi.15225；

1 摘要总结

微生物需要持续调整生理状态以适应多变环境，高盐极端环境中的嗜盐古菌具备极强环境适应能力，模式古菌沃氏盐古菌可随营养、细胞密度改变细胞形态、生物膜形成与运动能力，但该生活方式转换的调控机制尚不明确。前期研究发现转录因子TrmB可在盐杆菌中激活糖异生通路基因，生成糖基用于细胞表面糖蛋白合成，维持菌体杆状形态。本研究结合遗传操作与定量表型检测开展实验：证实TrmB是沃氏盐古菌糖异生培养条件下的必需基因；敲除trm的菌株在无糖培养基长期传代后，会在全新转录调控基因tbsP（Trm抑制子）上产生抑制突变；TbsP蛋白是菌体表面黏附、正常细胞形态与运动能力维持的关键蛋白；功能基因组、染色质免疫共沉淀、启动子融合实验共同证明TrmB与TbsP可葡萄糖依赖型协同调控糖异生关键基因gapII；最终证明二者共同调控糖异生代谢通路，通过下游代谢变化介导沃氏盐古菌响应营养信号完成生活方式切换。

2 中文关键词

古菌，细胞形态，中心代谢，基因调控网络，糖异生，沃氏盐古菌，转录因子

3 研究目的

1. 筛选沃氏盐古菌内TrmB同源蛋白HVO_2688，验证TrmB调控糖异生的功能在嗜盐古菌中是否保守；

2. 定位ΔtrmB缺失株在无糖糖异生培养基恢复生长的次级抑制突变，鉴定并系统表征新型转录因子TbsP；

3. 解析TbsP对沃氏盐古菌细胞形态、运动能力、生物膜附着三大发育表型的调控功能；

4. 挖掘TrmB与TbsP共同靶向的调控基因，阐明二者协同调控基因转录的分子机制；

5. 搭建转录因子—中心糖代谢—细胞生活方式转换的完整调控通路，解释沃氏盐古菌形态、运动、黏附表型转换的分子逻辑。

4 研究思路

1. 生物信息学多序列比对、蛋白结构域预测，筛选沃氏盐古菌TrmB同源蛋白HVO_2688（图1、表1）；

2. 构建ΔtrmB敲除株、空载对照株、trmB回补菌株，采用芬兰Bioscreen高通量微生物生长仪检测有无葡萄糖两种条件下的生长曲线，验证TrmB为糖异生生长必需基因（图2）；

3. 将ΔtrmB菌株持续无糖传代获得生长回复突变株，对突变株开展全基因组重测序，确定全部抑制突变均位于tbsP基因（图3、表2）；

4. 开展TbsP蛋白结构预测、跨古菌同源进化分析，证实TbsP为嗜盐古菌保守的新型MarR家族转录调控蛋白（图4）；

5. 构建ΔtbsP单敲除、ΔtrmBΔtbsP双敲除菌株，光学显微镜结合ImageJ定量细胞圆形度、细胞长宽比，分析TbsP对细胞形态的调控作用（图5、表S3）；

6. 分别对ΔtbsP、ΔtrmB突变株开展RNA-seq转录组测序，对比野生型筛选二者共同调控的糖异生核心基因gapII、ppsA、fbp（图6、表S4）；

7. 构建TbsP-HA标签菌株进行ChIP-seq，全基因组定位TbsP结合位点，确认gapII启动子是TbsP直接结合区域（图7、表3）；

8. 顺式作用元件基序预测、RT-qPCR定量基因表达、bgaH启动子报告基因检测，解析TrmB激活、TbsP抑制gapII转录的拮抗调控模式（图8）；

9. 软琼脂运动平板实验、96孔板结晶紫附着定量实验，检测TbsP对菌体运动、生物膜黏附表型的调控（图9）；

10 整合遗传学、多组学、定量表型全部数据，构建TrmB-TbsP通过共调控gapII连接糖代谢与古菌细胞发育的分子调控模型。

5 研究亮点

1. 首次在沃氏盐古菌中证实TrmB是糖异生条件下生长必需基因，完善TrmB家族转录因子在嗜盐古菌中保守的碳代谢调控功能；

2. 通过全基因组重测序挖掘得到古菌全新特异性转录因子TbsP，tbsP功能缺失可完全回补ΔtrmB的无糖生长缺陷，扩充古菌转录调控网络关键组分；

3. 首次发现一对功能拮抗的转录因子协同调控同一个糖异生核心基因gapII：无葡萄糖时TrmB激活gapII转录，有葡萄糖时TbsP抑制gapII转录；

4. 证实TbsP独立调控古菌运动、生物膜附着与细胞形态，TrmB仅调控碳代谢，二者分工协作实现营养信号向细胞发育表型的传递；

5. 完整建立“营养信号-双转录因子-糖异生通路-细胞生活方式转换”调控链条，填补古菌形态/运动/黏附切换分子机制研究空白。

6 可延伸的研究方向

1. 探究TrmB、TbsP蛋白感知葡萄糖的分子结构基础，解析二者与gapII启动子竞争性结合的体外互作机制；

2. 检测TrmB、TbsP在不同盐浓度、氧化胁迫等环境下的表达变化，拓展双因子的环境响应调控网络；

3. 挖掘TbsP间接调控运动、生物膜相关基因的中间代谢/转录通路，明确糖基前体介导表型转换的完整途径；

4. 在其他嗜盐古菌中验证TbsP同源蛋白功能，探究该调控通路的进化保守性；

5. 改造gapII启动子关键顺式元件，定量TrmB/TbsP结合亲和力变化对菌体形态、运动的梯度影响；

6. 代谢组检测各突变株糖异生中间产物含量，建立糖代谢中间物与细胞表面糖基化、表型的定量关联。

7 测量的数据及对应图表、研究意义

1. TrmB同源蛋白序列、结构域、同源相似度数据（图1、表1）：明确HVO_2688是沃氏盐古菌功能同源TrmB，为后续基因敲除提供靶点，奠定研究基础；

2. Bioscreen高通量微生物生长曲线、最大生长速率μmax（图2、图5a、图5b）：直观证明TrmB无糖生长必需，tbsP突变可回补ΔtrmB生长缺陷，量化各菌株生长差异；

3. tbsP基因抑制突变位点、突变类型数据（图3、表2）：直接证明tbsP是ΔtrmB生长缺陷的唯一抑制基因，锁定新型转录因子研究对象；

4. TbsP蛋白三级结构、同源物种分布、多序列比对数据（图4）：判定TbsP属于保守MarR家族转录因子，佐证其DNA结合调控功能；

5. 细胞圆形度、长宽比形态定量数据（图5c、图5d、表S3）：证明TbsP缺失会使菌体持续保持杆状，无法向圆盘状转换，确定TbsP调控细胞形态；

6. RNA-seq差异基因聚类、共有差异基因集合（图6、表S4、表S5）：筛选得到TrmB与TbsP共同靶向的糖异生基因gapII、ppsA、fbp，锁定核心调控靶标；

7. TbsP全基因组ChIP-seq富集峰、结合基序、靶基因注释（图7、表3、表S6）：直接证明TbsP结合gapII启动子，gapII是TbsP直接调控靶基因；

8. gapII基因RT-qPCR表达量、启动子bgaH酶活、转录本亚型测序数据（图8）：明确TrmB激活、TbsP抑制gap的拮抗调控模式，阐明葡萄糖依赖转录调控分子机制；

9. 软琼脂运动菌落面积、结晶紫黏附定量Log10分值（图9）：证明TbsP缺失导致菌体高运动、低黏附，TrmB不参与运动与生物膜调控，区分两个转录因子功能分化。

8 整体研究结论

1. 沃氏盐古菌HVO_2688编码功能保守TrmB转录因子，缺失后菌株无法在无糖糖异生培养基生长，为葡萄糖营养缺陷型；

2. ΔtrmB菌株长期无糖传代后，仅会在tbsP（HVO_2861）基因产生功能缺失抑制突变，tbsP失活可恢复ΔtrmB的无糖生长能力；

3. TbsP是嗜盐古菌特有新型MarR家族转录因子，缺失后菌体形态持续呈杆状、运动能力显著提升、表面黏附与生物膜形成能力丧失；

4. TrmB与TbsP反向协同调控糖异生关键基因gapII：葡萄糖匮乏时TrmB结合启动子激活转录，葡萄糖充足时TbsP结合启动子抑制转录；

5. TrmB仅负责碳代谢调控，TbsP同时调控中心糖代谢、细胞形态、运动、生物膜附着；二者通过共调控gapII连接葡萄糖营养信号与古菌细胞发育、生活方式切换。

9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义

本研究使用BioscreenC高通量生长仪自动测定各菌株OD600随时间变化的生长曲线，每30分钟自动读数，批量平行检测多菌株有无葡萄糖两种培养条件，该组数据核心意义如下：

1. 基因功能的表型初筛金标准：图2通过野生型、ΔtrmB、空载对照、trmB回补株生长曲线对比，直接直观证明ΔtrmB仅在无糖条件完全丧失生长，添加葡萄糖或质粒回补trmB可完全恢复生长，明确TrmB是糖异生通路必需转录因子，快速锁定基因核心生理功能；

2. 抑制突变表型定量验证：图3中ΔtrmB原始菌株无糖下几乎无生长，而tbsP突变的回复株生长曲线显著恢复，定量证明tbsP突变可完全抑制ΔtrmB致死表型，为后续重测序定位突变位点提供明确表型依据；

3. 多突变株生长差异精准量化（图5a、图5b）：同步检测野生、ΔtrmB、ΔtbsP、双敲除四株菌在有无葡萄糖下的生长曲线，计算最大瞬时生长速率μmax，统计检验证明ΔtbsP仅存在轻微生长劣势，双敲除可部分恢复ΔtrmB生长缺陷；同时区分OD数值差异来源——并非真实增殖速度改变，而是ΔtbsP细胞形态（杆状）造成光散射差异，规避分光光度法检测误差；

4. 高通量、自动化减少人为误差：传统摇瓶单管检测通量低、取样误差大，Bioscreen可同步批量测定数十株菌株，全程避光恒温振荡培养，固定时间间隔自动测光密度，生物学重复可靠性更高，生长曲线95%置信区间可直观展示组间差异显著性；

5. 为多组学表型提供生理基线：生长曲线作为基础生理表型，与转录组、细胞形态、运动黏附数据联动，建立“基因—生长代谢—细胞发育”完整证据链，证明碳代谢缺陷是ΔtrmB所有下游表型的根源；

6. 营养条件对照标准化：统一设置有/无糖平行培养，精准区分葡萄糖对各突变株生长的挽救效应，直观体现TrmB、TbsP调控的葡萄糖依赖性特征，支撑二者拮抗调控gapII的分子模型。