A novel metagenomic approach uncovers phage genes as markers for increased disinfectant tolerance in mixed Listeria monocytogenes communities

一种新型宏基因组方法揭示噬菌体基因可作为混合单增李斯特菌群落消毒剂耐受性升高的标志物

来源：Infection, Genetics and Evolution, Volume 119, 2024, Article ID 105582

《感染、遗传与进化》，2024年，第119卷，文章编号105582

 

摘要

单增李斯特菌是高致死率食源性致病菌，熟食摄入是主要感染途径，消毒剂耐受菌株易在食品加工环境长期存留。过往多采用纯培养研究其耐药基因，难以筛选变异耐受菌株。本研究构建两组分别含71株、80株单增李斯特菌的混合菌群，分别采用苯扎氯铵（BC，季铵盐类消毒剂）、过氧乙酸（PAA，过氧化物类消毒剂）亚致死浓度处理，通过宏基因组测序对比消毒处理组与空白对照组基因丰度差异。结果显示两种消毒剂处理后李斯特噬菌体相关基因丰度均显著上升；携带emrC基因的高拷贝质粒pLmN12–0935丰度在处理组明显下降；过氧乙酸处理组中ABC转运蛋白相关基因成为区分组别关键标记。该宏基因组手段可用于发掘混合菌群中消毒剂耐受相关基因。

 

关键词

宏基因组鸟枪法；单增李斯特菌；消毒剂耐受性；季铵盐；混合菌群；食品安全

 

研究目的

1 建立适用于混合单增李斯特菌群落的宏基因组筛选方法，突破传统纯培养筛选耐受基因的局限。

2 探明苯扎氯铵、过氧乙酸两种食品常用消毒剂胁迫下，混合李斯特菌群基因丰度变化规律，筛选消毒剂耐受相关分子标记基因。

3 明确质粒、噬菌体基因、已知耐药基因在消毒压力下的丰度变化，解析菌群耐受相关遗传特征，为食品车间消毒管控提供分子依据。

 

研究思路

1 从330株不同来源、不同地域的测序单增李斯特菌里，分别组建71株BC受试混合菌群、80株PAA受试混合菌群，完成菌株分型、耐药基因预筛查。

2 使用Bioscreen仪器筛选亚致死消毒剂浓度，设置空白对照组、初始样品组、消毒剂处理组，分两个生物学重复开展培养处理。

3 各组提取总DNA，宏基因组高通量测序，将测序序列比对泛基因组、质粒、耐药、毒力、MLST五大自建数据库，计算FPKM基因丰度。

4 借助PCA主成分分析筛选差异基因，统计功能分类，分析噬菌体、质粒、耐药基因丰度变化规律。

5 总结分子标志物，评价该宏基因组方法的通用性。

 

研究亮点

1 首次利用宏基因组技术在混合李斯特菌群落体系筛选消毒耐受基因，摆脱纯培养试验局限性，更贴合食品环境菌群实际生存状态。

2 证实噬菌体相关基因为两类消毒剂胁迫下共同的耐受标志物，拓展李斯特菌消毒剂抗性相关基因认知。

3 发现携带emrC的高拷贝质粒pLmN12–0935在消毒后丰度下调，阐明质粒携带带来的菌体生存代价。

4 区分两种消毒剂的抗性相关遗传差异：PAA处理体系细胞膜相关ABC转运蛋白基因显著改变，BC体系以噬菌体基因变化为主。

 

可延伸的方向

1 拓展更多种类食品消毒剂（含含氯消毒剂），验证噬菌体基因作为广谱耐受标记的可行性。

2 在生物膜混合李斯特菌群中应用本宏基因组方案，探究生物膜环境下耐药基因变化规律。

3 开展体内试验，探究噬菌体基因与李斯特菌致病性、环境定植能力的关联。

4 基于已筛选标记基因开发快速荧光PCR检测试剂盒，用于食品加工环境耐药李斯特快速筛查。

 

测量的数据及研究意义

1 菌株系统发育进化树数据、菌株来源/血清型/耐药基因携带信息，来源于图1；意义：明确两组混合菌群遗传背景差异，解释菌株选材合理性，为后续基因丰度变化提供本底参照。

 

2 五大数据库（泛基因组、质粒、MLST、毒力、消毒剂抗性）基因总FPKM丰度，来源于图2；意义：从整体层面明确消毒处理对菌群基因组、质粒、抗性基因总量的影响趋势。

 

3 单个质粒、单个抗性基因、毒力基因FPKM丰度，来源于图3、图4；意义：精确定位pLmN12–0935质粒、emrC基因在消毒后丰度下降特征。

 

 

4 PCA分组差异数据、top50差异基因功能分类统计，来源于图5、图6；意义：确定噬菌体基因为核心差异标志物，区分两种消毒剂作用对应的基因功能变化。

 

 

 

结论

1 苯扎氯铵与过氧乙酸处理后，混合单增李斯特菌内噬菌体关联基因丰度均显著升高，前噬菌体携带可提升菌群整体消毒剂耐受能力。

2 携带emrC耐药基因的高拷贝质粒pLmN12–0935在两种消毒剂胁迫后丰度均下降，质粒携带会在消毒+营养竞争环境下带来菌体生存成本，导致携带菌株被淘汰。

3 本研究建立的宏基因组分析方法可靠，可广泛用于各类混合致病菌群落的抗消毒剂基因挖掘，也可用于生物膜菌群抗性研究。

 

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1 通过Bioscreen连续测定OD540生长曲线，精准筛选不抑制菌群整体生长的亚致死BC、PAA工作浓度，避免消毒剂浓度过高直接大量灭菌而无法观测基因丰度变化，保障试验条件科学可控。

2 实时动态监测不同消毒剂梯度下菌群生长趋势，确定最优处理浓度（BC 1.75mg/L、PAA38mg/L），统一全试验处理标准，提升生物学重复之间数据重复性。

3 区分抑菌浓度与亚致死胁迫浓度，保证试验仅由消毒应激诱导基因表达与菌群结构变化，排除菌体大量死亡带来的基因丰度干扰，确保后续宏基因组测序数据真实反映耐受相关基因变化。

4 快速批量筛选96孔板内多梯度消毒剂组别，大幅缩短预实验周期，提升试验效率。