Estimation by flow cytometry of percentages of survival of Listeria monocytogenes cells treated with tetracycline, with or without prior exposure to several biocides
采用流式细胞术评估预先接触多种杀菌剂与否的单核细胞增生李斯特菌经四环素处理后的细胞存活率
来源：Food Microbiology, Volume 112, 2023, Article number 104210
《食品微生物学》，2023年，第112卷，文章编号 104210
摘要
本研究探究食品加工常用三种杀菌剂（苯扎氯铵、次氯酸钠、过氧乙酸）亚抑菌浓度预处理单核细胞增生李斯特菌后，菌株对四环素耐药性的变化。先测定三种杀菌剂对受试菌株的最低抑菌浓度，逐步提高亚抑菌药剂浓度驯化细菌，得到菌株可耐受的最大药剂浓度；将未预处理和经杀菌剂驯化的菌体置于6个梯度四环素浓度下分别培养24、48、72h，利用SYTO9与PI双染结合流式细胞术统计活菌占比。结果显示，经过氧乙酸预处理的菌体在多数四环素浓度与培养时间下存活率显著更高。该结果存在公共卫生隐患，四环素常用于李斯特菌病临床治疗，证实食品环境避免亚抑菌浓度消毒剂使用十分关键，同时流式细胞术可快速定量检测细菌抗生素耐药水平。
关键词
单核细胞增生李斯特菌；抗生素耐药；消毒剂；流式细胞术
研究目的
1 测定苯扎氯铵、次氯酸钠、过氧乙酸对单核细胞增生李斯特菌的最低抑菌浓度与驯化后耐受上限浓度；
2 明确亚抑菌浓度三种杀菌剂预处理是否提升李斯特菌对四环素的耐药存活能力；
3 验证流式细胞染色法快速定量检测细菌抗生素存活率的实用价值。
研究思路
1 选用食品来源4b型单核细胞增生李斯特菌NCTC 11994作为试验菌株，配制三种受试杀菌剂工作液；
2 借助Bioscreen仪器测定各杀菌剂MIC值，通过逐步升高药剂浓度连续传代培养，驯化细菌并确定驯化后可生长的最高杀菌剂浓度；
3 分组设置空白对照组（无杀菌剂预处理）、三种杀菌剂预处理组，各组菌体分别用0~1250ppm六个梯度四环素在30℃处理24h、48h、72h；
4 SYTO9/PI双荧光染料对菌体染色，流式细胞仪区分活死细胞，统计各组细菌存活率；
5 采用统计学分析各组存活率差异，汇总试验数据并分析药剂预处理、四环素浓度、作用时长与细菌存活率的关联规律。
研究亮点
1 首次利用流式细胞术系统对比三种常用食品消毒剂亚抑菌暴露后李斯特菌的四环素耐药变化规律；
2 证实过氧乙酸低剂量预处理可显著提升李斯特菌对四环素耐受能力，苯扎氯铵次之，次氯酸钠无明显促耐药效果；
3 联用Bioscreen浊度检测与流式荧光定量两种手段，分别从菌体生长宏观、细胞存活微观双层面解析耐药变化；
4 明确食品加工中亚抑菌浓度消毒剂滥用会诱发致病菌交叉耐药，为食品车间消毒规范制定提供试验依据。
可延伸的方向
1 拓展不同血清型、食品分离源的单核细胞增生李斯特菌菌株，验证结论普适性；
2 探究三种杀菌剂联用亚抑菌暴露对李斯特菌多重抗生素交叉耐药的影响；
3 结合分子生物学手段（基因测序、外排泵表达检测）解析杀菌剂诱导四环素耐药的内在机理；
4 模拟真实食品基质与生产环境，在实际食品表面开展消毒剂与抗生素联用试验。
测量的数据及研究意义
1 三种杀菌剂MIC数值、细菌驯化后耐受最高药剂浓度，数据来自表1；该数据量化李斯特菌对三类消毒剂固有敏感性与驯化适应能力，苯扎氯铵MIC最低但驯化后耐受提升幅度最大，直观证明亚抑菌持续接触可促使细菌产生消毒剂适应性，为消毒剂使用剂量管控提供基础参考。
2 不同四环素浓度、不同培养时长下四组菌体的细胞存活率数据，数据来自表2、图8；量化杀菌剂预处理、四环素剂量、处理时间三者对细菌存活的协同影响，证实过氧乙酸预处理显著提高菌体四环素存活率，揭示消毒剂与抗生素交叉耐药风险，警示食品行业管控消毒药剂使用浓度。
3 流式细胞活死细胞分区散点图数据，数据来自图1~图7；通过荧光分区直观区分活细胞与死亡细胞，验证SYTO9/PI染色-流式检测体系可高效区分菌体存活状态，证明流式细胞术可快速替代传统培养法定量耐药活菌，优化抗生素药敏检测手段。
结论
1 单核细胞增生李斯特菌经苯扎氯铵、次氯酸钠亚抑菌浓度连续培养后可产生药剂适应性，其中苯扎氯铵驯化后耐受浓度提升4.25倍，菌株对过氧乙酸驯化适应幅度最弱。
2 亚抑菌过氧乙酸预处理可显著提升李斯特菌四环素耐药存活率，苯扎氯铵预处理小幅提升耐药性，次氯酸钠预处理无明显促耐药效果；四环素浓度越高、处理时间越长，各组细菌存活率整体越低。
3 SYTO9与PI双染联合流式细胞术能够快速、精准定量细菌存活率，是检测李斯特菌抗生素耐药的高效简便方法；食品加工环境严禁亚抑菌剂量消毒剂使用，避免诱导致病菌产生抗生素交叉耐药，降低李斯特菌病临床治疗难度。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 Bioscreen通过连续测定菌液OD值判定细菌生长与否，精准测得三种杀菌剂对李斯特菌的MIC，相较传统试管肉眼判读，实现生长数据客观量化，减少人为读数误差，准确标定药剂基础抑菌浓度。
2 依托仪器实时动态浊度监测，完成细菌逐级药剂驯化试验，精准确定各杀菌剂驯化后菌株最大耐受浓度，量化细菌对消毒剂的适应潜力，建立亚抑菌暴露-细菌耐药驯化的剂量数据模型。
3 Bioscreen获取的生长终点数据为后续四环素耐药试验分组提供浓度依据，串联药剂驯化与抗生素胁迫两大试验环节，和后续流式细胞存活率结果形成宏观生长+微观细胞存活的完整数据链条，相互印证杀菌剂诱导交叉耐药的试验结论。