Loss of U1498 methylation in 16S rRNA by RsmE methyltransferase associates its role with aminoglycoside resistance
RsmE甲基转移酶介导的16S rRNA U1498位点甲基化缺失与分枝杆菌氨基糖苷类耐药性的关联研究
来源：Journal of Global Antimicrobial Resistance, Volume 23, 2020, Pages 359-369, doi:10.1016/j.jgar.2020.10.006
《全球抗菌药物耐药性杂志》，第23卷，2020年，第359至369页
摘要
核糖体甲基转移酶突变是细菌产生耐药性的重要机制。目前仅RsmG被证实与分枝杆菌低水平耐药相关，分枝杆菌RsmE可特异性甲基化16S rRNA的U1498位点，该位点位于氨基糖苷类抗生素结合区域，但该甲基化修饰与耐药的关联尚不明确。本研究利用自杀载体构建耻垢分枝杆菌RsmE基因敲除株，结合回补菌株，开展多类抗生素药敏实验。结果显示，RsmE缺失导致U1498甲基化消失，菌株对结合于该区域的氨基糖苷类药物最低抑菌浓度提升至少2倍，且无交叉耐药；结核分枝杆菌临床菌株数据分析发现，编码RsmE的Rv2372c基因存在大量非同义突变，突变丰度仅次于RsmG。本研究首次证实16S rRNA U1498甲基化缺失会引发分枝杆菌低水平氨基糖苷类耐药，为临床耐药防控提供新依据。
关键词
RsmE甲基转移酶；16S rRNA；U1498甲基化；分枝杆菌；氨基糖苷类抗生素；耐药性；基因敲除；最低抑菌浓度；核糖体；临床菌株突变
研究目的
探究分枝杆菌RsmE介导的16S rRNA U1498位点甲基化缺失是否引发抗生素耐药；明确该甲基化修饰对不同类别抗生素药效的影响，判断耐药特异性；分析RsmE基因在结核分枝杆菌临床菌株中的突变特征；阐释U1498位点甲基化影响抗生素作用的结构基础，揭示新型耐药机制。
研究思路
首先借助自杀载体技术构建耻垢分枝杆菌RsmE基因敲除株，并构建对应的基因回补菌株，通过PCR、引物延伸实验验证基因敲除与甲基化表型；其次利用芬兰Bioscreen生长分析仪检测野生株、敲除株、回补株在常规及氧化、渗透压、酸性等多种胁迫环境下的生长情况；然后采用微量肉汤稀释法，分别检测三类抗生素（30S核糖体靶向药、50S核糖体靶向药、非核糖体靶向药）对各菌株的最低抑菌浓度，分析耐药表型；接着检索PATRIC数据库中大量结核分枝杆菌临床菌株基因组数据，统计各类核糖体甲基转移酶的突变情况；最后结合核糖体晶体结构，分析药物结合位点与U1498位点的空间关系，解析耐药分子机制。
研究亮点
1. 首次证实分枝杆菌16S rRNA U1498位点甲基化缺失可诱导低水平氨基糖苷类耐药，补充核糖体修饰介导的新型耐药机制。
2. 明确该耐药具有高度特异性，仅针对结合于U1498周边的氨基糖苷类药物，无跨类别交叉耐药。
3. 发现结核分枝杆菌临床菌株中RsmE基因突变率极高，提示该基因变异是临床耐药演化的重要潜在因素。
4. 证实RsmE缺失会显著降低分枝杆菌在酸性环境下的生存能力，关联病原菌胞内定植适应性变化。
5. 结合核糖体晶体结构解析位点空间关系，从结构层面解释甲基化缺失改变药物结合效率的原因。
可延伸的方向
1. 研究RsmE基因突变类型与耐药水平、菌株毒力之间的对应关系。
2. 探究不同环境胁迫下RsmE表达量变化，以及对分枝杆菌耐药性的动态影响。
3. 针对U1498位点特征，设计新型抗菌化合物或耐药逆转剂。
4. 开展大规模临床样本筛查，分析RsmE突变与结核患者治疗效果的关联性。
5. 研究RsmE与RsmG等其他核糖体甲基转移酶的协同突变效应。
6. 分析U1498甲基化对分枝杆菌整体转录翻译功能的影响。
7. 评估现有抗菌方案对RsmE突变耐药菌株的治疗效果并优化用药策略。
测量的数据及研究意义
1 菌株基因鉴定与16S rRNA甲基化检测数据，数据来自图1、图2。研究意义：成功验证RsmE基因敲除株、回补株构建有效，确认敲除株完全丧失U1498位点甲基化能力。
2 常规培养及氧化、渗透压、酸性、亚硝基等胁迫条件下菌株生长曲线数据，数据来自图3、图4。研究意义：明确RsmE缺失仅显著影响菌株耐酸性能力，对多数胁迫环境耐受性无明显改变。
3 不同类别抗生素作用下菌株生长情况及最低抑菌浓度数值，数据来自图5、图6、表2。研究意义：证明RsmE缺失仅使特定氨基糖苷类药物抑菌浓度翻倍，不存在交叉耐药，确定耐药特异性。
4 结核分枝杆菌临床菌株中各类核糖体甲基转移酶突变统计数据，数据来自图7。研究意义：表明RsmE在临床菌株中突变频率位居第二，提示其与临床耐药密切相关。
5 抗生素在核糖体上的结合位点及空间距离数据，数据来自图8。研究意义：从结构角度解释仅邻近U1498的氨基糖苷类药物受影响的原因。
结论
1 耻垢分枝杆菌RsmE甲基转移酶负责16S rRNA U1498位点甲基化，该基因敲除会彻底消除此甲基化修饰。
2 U1498甲基化缺失会特异性提升分枝杆菌对卡那霉素、阿米卡星等邻近结合的氨基糖苷类药物的最低抑菌浓度，产生低水平耐药，对其他类别抗生素无交叉耐药现象。
3 RsmE基因缺失会显著削弱分枝杆菌在酸性环境中的生长能力，影响其胞内生存适应性。
4 结核分枝杆菌临床分离株中RsmE基因存在大量非同义突变，该基因变异是临床分枝杆菌耐药发生的重要潜在诱因。
5 核糖体U1498位点的甲基化状态会改变周边药物结合区域的空间构象，进而影响氨基糖苷类抗生素的作用效果，该机制可为结核耐药防控提供新靶点。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用**芬兰Bioscreen Growth Curve微生物生长分析仪**开展菌株生长动态监测。第一，设备搭载高通量培养板，可同时设置野生株、敲除株、回补株以及多组胁迫、药物浓度实验组，满足大批量平行检测需求，提升实验效率。第二，仪器按照设定间隔持续检测600nm吸光度，长时间完整记录菌株生长全过程，精准绘制生长曲线，可直观区分生长速率、迟滞期等表型差异。第三，设备统一培养温度、振荡模式与培养环境，规避人工操作带来的误差，保证不同组别数据横向对比的可靠性。第四，在药敏实验中，依靠仪器持续监测菌株生长状态，精准判定最低抑菌浓度，保障耐药表型数据准确。第五，该设备获取的生长数据，完整呈现了RsmE缺失对菌株基础生长、各类环境耐受性以及药物敏感性的影响，是本研究表型分析的核心支撑。