CroR Regulates Expression of pbp4(5) to Promote Cephalosporin Resistance in Enterococcus faecalis
CroR调控pbp4(5)的表达以促进粪肠球菌对头孢菌素的耐药性
来源：mBio, Volume 13, Issue 4, July/August 2022, doi:10.1128/mbio.01119-22
《mBio》，第13卷，第4期，2022年7-8月
摘要
粪肠球菌是条件致病菌，也是院内严重感染的主要致病菌，该菌对多种抗生素耐药，头孢菌素类药物治疗更是因粪肠球菌固有耐药而效果不佳。头孢菌素会通过修饰青霉素结合蛋白（PBPs）活性位点抑制细菌肽聚糖交联，而粪肠球菌中的Pbp4(5)和PbpA(2b)对头孢菌素反应活性低，可在药物作用下维持肽聚糖交联功能进而介导耐药，但这两种蛋白的调控机制尚不明确。CroS/R双组分信号转导系统同样是粪肠球菌头孢菌素耐药的必要条件，该系统被头孢菌素激活后会调控基因表达，但其下游发挥耐药作用的靶基因仍未明晰。本研究利用RNA-seq解析CroR介导的转录组变化，在多个不同谱系的粪肠球菌中证实pbp4(5)属于CroR调节子。通过对pbp4(5)和croR启动子进行遗传分析，鉴定出依赖CroR发挥作用的调控基序。对该基序进行突变后，细胞壁应激状态下pbp4(5)无法被CroR上调，粪肠球菌对头孢菌素的耐药性随之下降。研究证实，CroS/R系统通过提升Pbp4(5)及其他肽聚糖合成相关蛋白的表达，推动粪肠球菌产生头孢菌素耐药性，该成果也为防治肠球菌所致致命感染提供了分子机制参考。
关键词
双组分信号系统；CroR；Pbp4(5)；头孢菌素耐药；粪肠球菌；青霉素结合蛋白
研究目的
解析粪肠球菌中CroS/R双组分系统介导头孢菌素固有耐药的具体分子机制，明确CroR调控的下游关键靶基因，探究CroR、靶基因pbp4(5)与头孢菌素耐药三者之间的关联，鉴定CroR发挥转录调控作用的DNA基序，验证pbp4(5)表达上调对粪肠球菌头孢菌素耐药表型的必要性。
研究思路
首先以粪肠球菌OG1菌株为研究对象，分别设置野生株与croR缺失株，在杆菌肽诱导细胞壁应激的条件下开展RNA-seq，筛选CroR调控的差异表达基因，并通过qRT-PCR验证转录组结果；其次从差异基因中筛选肽聚糖合成相关基因，结合药敏实验锁定核心基因pbp4(5)，同时验证该调控关系在多株不同谱系粪肠球菌中具有保守性；接着利用5'RACE确定pbp4(5)转录起始位点，构建lacZ报告基因融合载体，通过启动子截短、定点突变实验，定位pbp4(5)和croR启动子上依赖CroR的保守调控基序，并验证CroR磷酸化是其转录调控功能发挥的前提；然后构建启动子基序突变菌株，借助qRT-PCR、免疫印迹检测pbp4(5)的转录与蛋白表达水平变化；最后通过最低抑菌浓度（MIC）实验、纸片扩散实验，明确CroR介导pbp4(5)上调对头孢菌素耐药的影响，并结合实验结果梳理CroS/R系统的整体调控网络。
研究亮点
1. 首次证实pbp4(5)是粪肠球菌CroR调节子的成员，阐明了CroS/R双组分系统、Pbp4(5)与头孢菌素固有耐药的直接调控关系。
2. 鉴定出croR与pbp4(5)启动子上保守的8核苷酸AT富集调控基序（TTTATTAA），明确该基序是CroR结合并启动下游基因转录的核心序列。
3. 证明CroR的磷酸化修饰是其激活pbp4(5)转录的必要条件，契合经典双组分信号通路作用模式。
4. 证实该调控通路在多株进化谱系不同的粪肠球菌中普遍存在，说明该机制是粪肠球菌物种层面的共性特征。
5. 区分了CroR调控的不同效应因子，发现pbp4(5)上调并非CroR介导头孢菌素耐药的唯一因素，完善了耐药调控网络。
可延伸的方向
1. 探究CroR调控基序在其他CroR靶基因中的分布，区分CroR直接调控与间接调控的基因，解析完整的CroR转录调控网络。
2. 研究Pbp4(5)与PbpA(2b)、MreC/D、MurT/GatD等其他肽聚糖合成相关蛋白的协同作用模式，明确多蛋白共同介导头孢菌素耐药的分子机制。
3. 以CroS/R双组分系统或保守调控基序为靶点，研发新型抗菌药物或佐剂，用于治疗多重耐药粪肠球菌感染。
4. 探究翻译水平上Pbp4(5)在细胞壁应激下不依赖CroR的表达上调机制。
5. 分析不同临床分离耐药粪肠球菌菌株中pbp4(5)启动子基序的突变情况，评估该基序与临床耐药表型的关联。
6. 研究CroS/R系统对除头孢菌素外其他细胞壁靶向抗生素耐药的调控通路差异。
测量的数据及研究意义
1 测定不同粪肠球菌菌株对第二代、第三代、第四代头孢菌素、氨苄西林、万古霉素的最低抑菌浓度（MIC），数据来自表1、表2。研究意义：直观对比野生株、croR缺失株、pbp4(5)缺失株、pbp4(5)启动子突变株以及基因过表达菌株的药物耐受能力，证明pbp4(5)、croR缺失和启动子调控基序突变会显著降低菌株对头孢菌素的耐药性，同时证实pbp4(5)表达变化不影响菌株对氨苄西林、万古霉素的耐药性。
2 利用qRT-PCR检测细胞壁应激条件下多株粪肠球菌中pbp4(5)的转录水平，数据来自图1、图4A。研究意义：验证细胞壁应激时CroR可显著上调pbp4(5)的转录，且该调控作用在不同粪肠球菌谱系中保守；同时证明启动子保守基序突变后，CroR无法诱导pbp4(5)转录上调。
3 测定β-半乳糖苷酶活性，分析不同启动子截短体、突变体的转录活性，数据来自图2、图3。研究意义：确定pbp4(5)转录依赖CroR，CroR磷酸化是其调控功能的基础；精准定位croR和pbp4(5)启动子上CroR结合的核心DNA基序，明确基序中关键核苷酸的功能。
4 采用免疫印迹检测Pbp4(5)、CroR的蛋白表达量，数据来自图4B。研究意义：在蛋白水平印证转录层面的实验结果，证明启动子基序突变会阻断CroR介导的Pbp4(5)蛋白上调，同时发现存在不依赖CroR的Pbp4(5)蛋白小幅上调现象。
5 开展头孢菌素纸片扩散实验，测量抑菌圈直径，数据来自图5。研究意义：补充MIC实验结果，从表型层面再次验证破坏CroR对pbp4(5)的调控后，粪肠球菌头孢菌素耐药性下降。
6 进行RNA-seq获得差异表达基因谱。研究意义：全面解析CroR调节子的组成，筛选出大量细胞壁合成、应激反应相关基因，为挖掘CroR下游其他耐药效应因子提供数据基础。
结论
1 粪肠球菌CroS/R双组分系统被细胞壁靶向抗生素激活后，通过响应调节蛋白CroR调控大量基因转录，pbp4(5)是其中核心的耐药相关靶基因。
2 croR与pbp4(5)启动子上存在保守的AT富集DNA基序TTTATTAA，该基序是CroR结合并启动基因转录的关键，破坏该基序会直接阻断CroR对pbp4(5)的上调作用。
3 CroR必须发生磷酸化修饰才能发挥转录激活功能，符合典型双组分信号转导通路的作用机制。
4 细胞壁应激状态下，CroR介导的pbp4(5)表达上调是粪肠球菌维持完整头孢菌素固有耐药表型的必要条件，该调控机制在多种粪肠球菌菌株中保守存在。
5 pbp4(5)上调并非CroR介导头孢菌素耐药的唯一途径，CroR还会调控PbpA(2b)、肽聚糖合成相关蛋白等多种因子，共同构建复杂的耐药调控网络。
6 pbp4(5)存在不依赖CroR的基础表达，且细胞壁应激下Pbp4(5)蛋白可出现不依赖CroR的小幅上调，该现象的分子机制有待进一步研究。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C酶标仪开展最低抑菌浓度实验，仪器可实时监测细菌培养体系的OD600数值，自动记录细菌生长情况并绘制生长曲线。其一，该仪器实现了高通量、自动化的药敏检测，减少人工操作带来的误差，精准判定能够完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度，保证MIC数据的准确性与重复性，为菌株耐药表型的判定提供可靠量化依据。其二，连续动态的生长监测可以区分细菌完全受抑、缓慢生长、正常生长等不同状态，辅助区分菌株耐药能力的强弱梯度，清晰对比野生株、基因缺失株、启动子突变株之间的耐药表型差异。其三，标准化的检测体系让不同实验组、不同菌株的药敏结果具备横向对比性，有力支撑“CroR调控pbp4(5)影响头孢菌素耐药”这一核心结论，同时也为后续相关菌株药敏实验建立了标准化检测方法。其四，该仪器的高通量特性可同时完成多株菌株、多种抗生素、多个浓度梯度的检测，大幅提升实验效率，支撑本研究中多谱系粪肠球菌、多种头孢菌素及对照抗生素的药敏筛选工作。