A Genetic Trap in Yeast for Inhibitors of SARS-CoV-2 Main Protease
用于筛选新冠病毒主蛋白酶抑制剂的酵母基因捕获体系
来源：mSystems, Volume 6, Issue 6, 2021, Article e01087-21
《mSystems》，第6卷第6期，2021年，文章编号e01087-21
摘要
本研究利用酿酒酵母构建了一套可筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的活体筛选平台。该体系依托大肠杆菌MazE-MazF毒素-抗毒素系统，在二者连接肽段中插入新冠病毒主蛋白酶酶切位点；当病毒蛋白酶表达并切割融合蛋白时，会释放毒性MazF蛋白抑制酵母生长，若存在蛋白酶抑制剂则切割过程受阻，酵母可正常生长。研究同时敲除酵母相关转运蛋白基因，提升小分子物质摄取能力，并引入荧光标记实现生长精准检测。实验证实该体系可低至1μM浓度下检出阳性抑制剂GC376，具备自动化高通量筛选潜力，还可根据病毒蛋白酶突变位点快速改造，适用于不同变异株抑制剂筛选。该活体模型规避了体外实验的缺陷，仅筛选可进入细胞且稳定存在的活性化合物，安全性与实用性突出。
关键词
酿酒酵母；新冠病毒；主蛋白酶；蛋白酶抑制剂；MazE-MazF毒素系统；高通量筛选；小分子化合物；基因工程；荧光标记；活体筛选
研究目的
构建基于酿酒酵母的新冠病毒主蛋白酶抑制剂活体正向筛选体系；优化菌株基因背景、基因表达调控条件，提升小分子物质吸收能力与检测灵敏度；验证筛选平台对已知抑制剂的识别效果，评估不同候选化合物的活性；验证平台的自动化适配性与可改造性，为冠状病毒蛋白酶类抑制剂高通量筛选提供可靠工具。
研究思路
首先对酿酒酵母进行基因改造，敲除药物外排相关转运蛋白基因，提升细胞对外源小分子的摄取效率；接着构建含新冠病毒主蛋白酶酶切位点的MazE-MazF融合蛋白表达载体，搭配不同启动子调控融合蛋白表达强度，同时转入mCherry荧光标记基因；然后利用不同甲硫氨酸浓度调控MET3启动子，优化融合蛋白表达水平，确定最佳实验条件；随后以GC376为阳性对照，设置多种候选抑制剂，分别借助芬兰Bioscreen C仪器与自动化筛选平台，通过光密度与荧光信号检测酵母生长状态；最后分析各化合物作用效果，评价平台灵敏度、特异性以及针对蛋白酶突变体的改造潜力。
研究亮点
1. 创新性利用毒素-抗毒素系统建立正向筛选模型，普通毒性化合物不会出现假阳性结果，筛选特异性更强。
2. 改造酵母转运蛋白基因，大幅提升细胞对小分子药物的摄取能力，优化筛选灵敏度。
3. 体系可实现活体细胞水平筛选，仅保留能穿透细胞、胞内稳定的活性化合物，弥补体外酶活实验的不足。
4. 检测方式兼容光密度与荧光两种信号，荧光检测信噪比更高，适配大规模自动化筛选工作站。
5. 可快速替换蛋白酶酶切位点，能应对新冠病毒变异株以及其他种类蛋白酶的抑制剂筛选需求。
6. 实验全程无需活病毒，实验安全等级要求低，应用场景更广。
可延伸的方向
1. 利用该高通量平台开展大规模化合物库筛选，发掘全新新冠病毒主蛋白酶抑制剂。
2. 针对新冠病毒不同变异株的主蛋白酶突变位点，改造酶切序列，搭建对应筛选模型。
3. 优化菌株与培养条件，进一步降低抑制剂最低检出浓度，提升检测灵敏度。
4. 结合分子对接等计算筛选手段，实现虚拟筛选与活体筛选联用，提升研发效率。
5. 拓展模型应用，用于其他病毒、病原菌蛋白酶抑制剂的开发工作。
6. 研究筛选出的活性化合物的作用机制、细胞毒性与体内抗病毒效果。
7. 优化启动子与表达元件，构建多靶点联用筛选体系。
测量的数据及研究意义
1 不同甲硫氨酸浓度下酵母生长光密度数据，数据来自图2。研究意义：确定MET3启动子的调控规律，筛选出可区分抑制剂作用效果的最佳甲硫氨酸浓度，为实验条件奠定基础。
2 不同浓度GC376作用下酵母生长数据，数据来自图3。研究意义：验证阳性抑制剂可显著恢复酵母生长，证明筛选体系功能有效。
3 多种候选抑制剂处理后酵母荧光信号与光密度数据，数据来自图4、图5。研究意义：对比不同化合物活性，区分真阳性与假阳性抑制剂，同时证实荧光检测灵敏度优于光密度检测。
4 不同浓度GC376对应的荧光、光密度信号比值及统计学数据，数据来自表2。研究意义：量化平台检测灵敏度，确定体系最低有效检出浓度为1μM，验证数据可靠性。
5 不同菌株对照组生长数据。研究意义：证明无目标蛋白酶、无融合毒素蛋白的对照组生长不受抑制剂影响，验证体系特异性。
结论
1 成功构建基于酿酒酵母和MazE-MazF毒素系统的新冠病毒主蛋白酶抑制剂活体正向筛选平台，菌株经转运蛋白基因敲除后，对小分子物质摄取能力显著提升。
2 该体系可通过光密度或荧光信号检测酵母生长，荧光检测信噪比和灵敏度更高，最低可检出1μM的阳性抑制剂GC376。
3 多种受试化合物中仅GC376表现出明显抑制活性，其余化合物无作用或存在细胞毒性，证明平台筛选特异性良好。
4 模型无需活病毒参与，实验安全性高，同时支持机器人自动化高通量筛选，适合大规模化合物筛选工作。
5 通过替换融合蛋白上的酶切位点，该平台可快速适配新冠变异株及其他蛋白酶的抑制剂筛选，通用性强。
6 该活体筛选体系弥补了体外酶实验的短板，优先筛选胞内有效化合物，可为抗冠状病毒药物研发提供高效工具。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用**芬兰Bioscreen C微生物生长分析仪**开展酵母生长检测实验。第一，设备配备100孔蜂窝培养板，可同时设置多浓度梯度、多实验组与对照组，满足梯度浓度测试、平行重复实验需求，适配前期条件摸索与活性验证工作。第二，仪器可长时间连续培养，每隔固定周期自动检测600nm光密度值，完整记录酵母生长全过程，精准绘制生长曲线，直观反映抑制剂对菌株生长的恢复效果。第三，设备可统一控制培养温度、振荡频率等环境参数，保证所有样本实验条件一致，消除人为误差，确保组间数据具备可比性。第四，依托该设备获取的生长数据，完成甲硫氨酸浓度梯度优化、抑制剂效价验证，确定整套实验的最优参数。第五，Bioscreen C获取的光密度数据与后续自动化平台的荧光数据相互印证，双重验证筛选结果的准确性，为平台性能评估提供了核心实验依据。