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Nitric Oxide–Releasing Nanoparticles Prevent Propionibacterium acnes–Induced Inflammation by Both Clearing the Organism and Inhibiting Microbial Stimulation of the Innate Immune Response

释一氧化氮纳米颗粒可清除痤疮丙酸杆菌并抑制其诱发的固有免疫应答

来源：Journal of Biological Chemistry, Volume 293, Issue 11, 2018, Pages 4000-4013, doi:10.1074/jbc.M117.805689

《生物化学杂志》，第293卷第11期，2018年，第4000-4013页

摘要

噬菌体识别并结合宿主细胞表面受体是侵染过程的起始关键步骤。以往研究发现，O1群埃尔托生物型霍乱的VP3噬菌体可结合霍乱弧菌脂多糖的核心低聚糖，但部分拥有完整核心低聚糖的野生霍乱弧菌仍对VP3具有抗性，且核心低聚糖缺陷突变株依旧能与VP3发生弱结合，提示该噬菌体侵染还依赖其他宿主表面因子。本研究证实霍乱弧菌外膜蛋白TolC是VP3的第二种细胞表面受体。实验表明TolC可与VP3尾丝蛋白gp44及其C端结构域直接互作，TolC表面环区的78、290、291位三个氨基酸残基是二者结合的关键位点。在VP3抗性野生霍乱弧菌菌株中，上述位点周边氨基酸频繁发生突变。该研究阐明了VP3侵染霍乱弧菌的双受体结合机制，脂多糖核心低聚糖与外膜蛋白TolC共同保障VP3完成有效侵染；TolC表面环区突变会使霍乱弧菌获得噬菌体抗性，帮助菌株在含VP3的环境中存活。

关键词

霍乱弧菌；VP3噬菌体；外膜蛋白TolC；噬菌体受体；尾丝蛋白；脂多糖；基因突变；噬菌体抗性

研究目的

明确霍乱弧菌中除脂多糖核心低聚糖外，介导VP3噬菌体吸附侵染的第二宿主受体；鉴定TolC与噬菌体尾丝蛋白结合的关键氨基酸位点；解析二者相互作用的分子机制；探究TolC基因突变与霍乱弧菌VP3抗性的关联；补充T7家族噬菌体与革兰氏阴性宿主互作的理论基础。

研究思路

首先利用转座子突变文库筛选获得VP3抗性霍乱弧菌突变株，通过基因定位锁定候选基因tolC；其次构建tolC敲除株、回补株，结合双层噬斑实验、噬菌体结合实验，验证TolC在VP3侵染过程中的作用；接着构建gp44不同截短片段，借助细菌腺苷酸环化酶双杂交系统、GST下拉实验，确定gp44与TolC的互作区域；然后比对多株敏感、抗性菌株的TolC氨基酸序列，筛选突变热点，定点突变关键位点并验证突变体的互作能力与菌株噬菌体敏感性；同时检测突变后TolC的寡聚状态、生理功能，排除蛋白结构异常带来的影响；最后综合所有实验结果，阐明VP3双受体侵染机制以及菌株抗噬菌体的分子原因。

研究亮点

1. 首次发现霍乱弧菌外膜蛋白TolC是VP3噬菌体的第二受体，明确该噬菌体依靠脂多糖核心低聚糖与TolC双受体完成侵染。

2. 精准定位TolC表面78、290、291位氨基酸为结合gp44的核心位点，且这些位点位于菌体表面暴露环区。

3. 证实霍乱弧菌通过上述位点的氨基酸突变获得VP3抗性，且突变不影响TolC自身寡聚结构与原有生理功能。

4. 确定VP3尾丝蛋白gp44依靠C端结构域与TolC发生特异性结合，完善T7家族噬菌体尾蛋白的功能认知。

5. 筛选得到多个与VP3抗性相关的潜在基因，为全面解析噬菌体-宿主互作网络提供新靶点。

可延伸的方向

1. 解析gp44分别结合脂多糖、TolC的时序过程与构象变化，明确噬菌体侵染动态机制。

2. 研究不同霍乱弧菌分型噬菌体与宿主外膜蛋白、脂多糖的受体差异。

3. 针对TolC保守结合位点设计靶向分子，探索噬菌体防控或噬菌体疗法的应用潜力。

4. 深入研究本实验筛选的其他VP3抗性相关基因的具体功能。

5. 探究不同环境下霍乱弧菌噬菌体受体突变的进化规律与种群分布特征。

6. 分析T7家族其他噬菌体是否普遍采用双受体侵染模式。

7. 研究TolC突变对霍乱弧菌毒力、耐药性等其他生物学表型的影响。

测量的数据及研究意义

1 借助透射电镜观察VP3噬菌体在霍乱弧菌表面的吸附形态，数据来自图1。研究意义：直观呈现噬菌体与宿主细胞的结合状态，为后续受体研究提供形态学依据。

2 开展双层噬斑实验、噬菌体结合荧光检测，对比野生株、tolC敲除株及回补株的噬菌体敏感性与结合能力，数据来自图2、图3、表3。研究意义：直接证明TolC是VP3侵染必不可少的受体，缺失TolC会大幅降低噬菌体结合效率并使菌株产生抗性。

3 利用细菌双杂交、GST下拉实验检测TolC与gp44及各截短片段的相互作用，结合qRT-PCR验证蛋白表达量，数据来自图4、图5。研究意义：确定gp44依靠C端结构域和TolC发生特异性互作，排除蛋白表达量干扰，明确互作功能区域。

4 比对多株敏感、抗性菌株的TolC氨基酸序列，分析突变位点分布，数据来自图6A。研究意义：锁定78、290、291位为高频突变位点，建立突变与噬菌体抗性的关联。

5 检测TolC定点突变体与gp44的互作能力、菌株噬菌体敏感性，数据来自图6B、图6C。研究意义：验证三个氨基酸残基是二者结合的关键，位点突变会直接阻断相互作用，使菌株产生抗性。

6 检测TolC突变体的寡聚状态、菌体对十二烷基硫酸钠和胆汁盐的耐受能力，数据来自图7。研究意义：证明位点突变仅影响噬菌体结合功能，不会改变TolC蛋白结构与原有生理活性。

7 分析TolC同源序列及其他抗性相关蛋白结构域，数据来自图8。研究意义：对比不同菌株TolC保守性，同时预测新抗性基因的功能，拓展研究范围。

结论

1 VP3噬菌体侵染O1群埃尔托型霍乱弧菌需要脂多糖核心低聚糖和外膜蛋白TolC两种受体，二者缺一不可。

2 VP3尾丝蛋白gp44主要通过C端结构域与TolC发生特异性相互作用。

3 TolC表面暴露环区的第78位丙氨酸、290-291位甘氨酸-谷氨酸是结合gp44的核心氨基酸，该区域发生突变或片段缺失会阻断二者结合。

4 霍乱弧菌可通过TolC上述位点的氨基酸突变获得VP3噬菌体抗性，且这类突变不会破坏TolC的蛋白寡聚结构与生理功能。

5 除tolC外，本研究还筛选出多个潜在的VP3抗性相关基因，有待进一步解析其功能。

6 该研究揭示了T7家族噬菌体典型的双受体侵染模式，解释了自然环境中霍乱弧菌对噬菌体产生抗性的分子机制。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

本研究使用芬兰Bioscreen C仪器监测霍乱弧菌在含胆汁盐、十二烷基硫酸钠培养基中的生长动态，全程定时检测OD值、记录生长曲线。第一，仪器可实现自动化长时间连续检测，减少人工操作带来的误差，精准对比野生株、TolC突变株的生长差异，判定突变是否影响菌株正常生理活性。第二，高通量检测模式可同时处理多组菌株与培养体系，保证平行实验条件统一，数据重复性强，可靠验证TolC突变仅针对噬菌体结合功能、不影响原有抗逆能力。第三，连续的生长数据能够完整展现菌株在胁迫环境下的生长周期，区分生长速率、最大菌体密度等指标，辅助评价TolC生理功能完整性。第四，该设备适配细菌胁迫培养实验，为微生物膜蛋白功能、噬菌体抗性相关表型检测建立标准化手段。第五，结合噬斑、蛋白互作结果，将菌株生长表型与分子机制关联，让实验结论更加严谨。