全自动生长曲线分析仪

Human milk oligosaccharides inhibit growth of group B Streptococcus

人乳低聚糖抑制B族链球菌生长

来源：Journal of Biological Chemistry, Volume 292, Issue 27, 2017, Pages 11243-11249, doi:10.1074/jbc.M117.789974

《生物化学杂志》，第292卷第27期，2017年，第11243-11249页

摘要

B族链球菌是引发新生儿侵袭性感染的主要致病菌，可通过母婴传播，且耐药菌株不断出现，临床防控难度加大。人乳低聚糖（HMO）具备调节婴儿免疫系统、塑造肠道菌群的作用，本研究发现HMO可不依赖宿主免疫，直接抑制B族链球菌生长。经多维色谱分离鉴定，具备抑菌活性的为非唾液酸化中性人乳低聚糖，该类物质还可与多种常规抗生素产生协同抑菌效果。通过转座子突变文库筛选，确定B族链球菌中一种糖基转移酶基因失活后会对HMO产生抗性，推测HMO可作为替代底物干扰该酶功能，进而阻碍细菌增殖。本研究揭示了HMO全新的抗菌功能，也为新生儿B族链球菌感染的防治提供了新思路。

关键词

人乳低聚糖；B族链球菌；中性低聚糖；抑菌作用；糖基转移酶；转座子突变；抗生素协同；细菌耐药；新生儿感染；色谱分离

研究目的

明确人乳低聚糖对B族链球菌的抑菌效果与作用特性；筛选具有抑菌活性的特定HMO组分；鉴定B族链球菌中响应HMO作用的关键基因与蛋白；探究HMO与抗生素联用的协同抑菌效应；阐明HMO抑制B族链球菌的分子机制。

研究思路

首先将混合人乳低聚糖作用于多种常见致病菌，验证其抑菌特异性，区分抑菌与杀菌特性；利用色谱技术将HMO分为酸性、中性组分，结合酶解处理明确活性组分类型；进一步分级纯化中性HMO，筛选单一组分并验证抑菌能力；构建B族链球菌转座子突变文库，筛选HMO抗性突变株，定位目标基因并构建敲除菌株进行验证；同时分析细菌荚膜、其他糖基转移酶相关突变株的敏感性；借助芬兰Bioscreen仪器实时监测细菌生长动态；最后测定HMO与不同抗生素联用的半数抑制浓度，评价协同作用效果。

研究亮点

1. 首次发现人乳低聚糖可直接抑制B族链球菌生长，区别于以往仅调节宿主免疫、阻断黏附的作用形式。

2. 明确中性非唾液酸化HMO是核心活性组分，且特定结构的低聚糖抑菌能力存在显著差异。

3. 定位到B族链球菌中GT8家族糖基转移酶gbs0738是HMO发挥作用的关键靶点。

4. 证实中性HMO可与万古霉素、环丙沙星产生协同抑菌作用，能够降低抗生素使用剂量。

5. 证明该抑菌作用不依赖细菌荚膜及其他糖基转移酶，作用靶点具有高度特异性。

可延伸的方向

1. 深入解析gbs0738糖基转移酶的生化特性，阐明HMO干扰酶功能的具体分子机制。

2. 优化活性中性低聚糖的提取、合成工艺，推进产业化应用。

3. 开展动物实验，验证HMO在体内对B族链球菌感染的防治效果。

4. 探究不同结构HMO组合的复合抑菌效果，开发复合抗菌制剂。

5. 结合临床样本，分析母乳中活性HMO含量与婴儿B族链球菌感染率的关联性。

6. 拓展研究HMO对其他新生儿致病菌的作用效果。

7. 基于协同效应，研发HMO联合抗生素的新型抗感染用药方案。

测量的数据及研究意义

1 多种致病菌在HMO作用下的生长数据，数据来自图1。研究意义：证明HMO仅特异性抑制B族链球菌，对测试的其他致病菌无作用，且该物质仅为抑菌而非杀菌。

2 酸性、中性HMO及低聚半乳糖处理后细菌生长数据，数据来自图2。研究意义：确定中性非唾液酸化HMO为主要抑菌活性组分，排除蛋白及普通低聚糖的干扰。

3 不同中性HMO分级组分、单一纯化低聚糖的抑菌数据，数据来自图3。研究意义：筛选出高活性的乳-N-四糖及其岩藻糖基衍生物，同时证实结构细微差异会大幅影响抑菌能力。

4 转座子突变株、基因敲除株及相关缺陷菌株的生长数据，数据来自图4。研究意义：证实gbs0738基因是B族链球菌对HMO产生应答的关键，荚膜与其他糖基转移酶不参与该过程。

5 单独及联合用药下细菌半数抑制浓度与协同指数数据，数据来自图5。研究意义：明确中性HMO与万古霉素、环丙沙星存在显著协同抑菌作用，可大幅提升抗生素药效。

结论

1 人乳低聚糖具备特异性抑菌能力，仅对B族链球菌发挥抑制作用，该作用为抑菌而非杀菌，且活性集中在中性非唾液酸化组分。

2 乳-N-四糖是核心活性单体，分子结构会直接影响抑菌活性，唾液酸化修饰会使HMO丧失抑菌能力。

3 B族链球菌的gbs0738编码糖基转移酶是HMO发挥作用的关键靶点，该基因失活会使细菌产生抗性，荚膜、其他糖基转移酶不参与该抑菌通路。

4 中性人乳低聚糖与万古霉素、环丙沙星联用可产生显著协同效应，有效降低抗生素使用浓度，有望缓解细菌耐药问题。

5 人乳低聚糖可通过干扰B族链球菌关键糖基转移酶功能抑制菌体增殖，为新生儿B族链球菌感染防控、新型抗菌制剂开发提供了新方向。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

本研究使用**Bioscreen C微生物生长分析仪**开展细菌生长动态检测。第一，设备采用高通量微孔板检测模式，可同时设置空白对照组、不同浓度HMO组、各类突变菌株组，实现大批量样本同步检测。第二，仪器每30分钟检测600 nm吸光度，长时间连续记录生长曲线，精准捕捉细菌生长速率变化，区分抑菌效果强弱。第三，设备统一培养温度、气体环境与振荡条件，实验体系标准化，规避人为操作误差，保证各组数据可横向对比。第四，该仪器用于转座子突变文库的高通量筛选，高效锁定HMO抗性菌株，大幅提升筛选效率。第五，依托仪器获取的连续生长数据，量化HMO、抗生素单独及联用的作用效果，为活性评价与机制验证提供可靠的实验支撑。