A Comprehensive Analysis of Replicative Lifespan in 4,698 Single-Gene Deletion Strains Uncovers Conserved Mechanisms of Aging
利用酵母模型鉴定恶性疟原虫磷酸盐转运蛋白抑制剂并开发新型抗疟药物筛选体系
来源：International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance, Volume 26, 2024, Article number 100567, doi:10.1016/j.ijpddr.2024.100567
《国际寄生虫学：药物与耐药性》，第26卷，2024年，文章编号100567
摘要
疟疾仍是威胁全球公共卫生的重大疾病，目前主流青蒿素联合疗法已出现广泛耐药问题，亟需研发新型抗疟药物。恶性疟原虫表达的钠耦合无机磷酸盐转运蛋白PfPiT是疟原虫无性血期增殖的必需蛋白，可作为理想药物靶点。本研究利用酿酒酵母构建筛选模型，敲除酵母自身五种磷酸盐转运基因，再导入疟原虫PfPiT基因，使酵母仅依靠PfPiT完成磷酸盐摄取。通过放射性磷酸盐摄取实验测定PfPiT酶学参数，证实其为钠依赖性转运蛋白。基于该工程菌株建立22小时生长筛选体系，对21种化合物进行筛选，最终得到两种可特异性抑制PfPiT的活性物质。放射性摄取实验进一步验证了化合物的抑制效果。该酵母生长检测体系操作简便、成本低廉，适用于大规模化合物库筛选，可为新型抗疟先导化合物挖掘提供可靠平台。
关键词
恶性疟原虫；PfPiT；磷酸盐转运蛋白；酿酒酵母；药物筛选；抗疟药物；高通量筛选；放射性示踪；抑制剂
研究目的
构建仅表达恶性疟原虫PfPiT转运蛋白的工程酵母菌株；表征PfPiT的转运动力学、离子及pH依赖性特征；建立基于酵母生长的高通量筛选体系；筛选靶向PfPiT的小分子抑制剂并验证活性；评估该筛选模型的稳定性与实用性，为新型抗疟药物研发提供技术支撑。
研究思路
首先改造模式酵母菌株，敲除内源磷酸盐转运基因Pho84，导入密码子优化的恶性疟原虫PfPiT基因，获得依赖PfPiT摄取磷酸盐的工程菌株；其次利用放射性³²P标记磷酸盐，测定不同钠浓度、pH条件下PfPiT的米氏常数，明确其功能特性；接着探究磷酸盐浓度、pH、氯化钠、溶剂等条件对工程酵母生长的影响，优化筛选体系参数，确定标准检测时长；然后以膦甲酸钠为阳性对照验证体系可靠性，再对21种候选化合物开展筛选；最后结合生长抑制实验与放射性摄取实验，确认候选抑制剂的作用效果，评价整个筛选平台的应用价值。
研究亮点
1. 成功构建以PfPiT为唯一磷酸盐转运蛋白的酿酒酵母工程菌株，建立了可靠的异源表达研究模型。
2. 完整表征PfPiT的转运特征，其功能与疟原虫原生状态下保持一致，模型保真度高。
3. 开发出简易、低成本的酵母生长型高通量筛选方法，相比放射性筛选更适合大规模化合物库筛查。
4. 筛选得到两种特异性PfPiT抑制剂，为新型抗疟药物研发提供先导分子。
5. 明确生长筛选与放射性摄取实验的互补性，形成“初筛+复证”的完整药物筛选流程。
6. 完成筛选体系方法学验证，各项指标符合高通量筛选标准，重复性与稳定性优异。
可延伸的方向
1. 扩大化合物筛选范围，依托该平台开展大规模小分子库筛选，挖掘更多高效PfPiT抑制剂。
2. 对已获得的两种活性化合物进行结构优化，提升抑制活性与靶向特异性。
3. 在疟原虫活体模型中验证候选药物的抗疟药效与安全性。
4. 探究抑制剂与PfPiT蛋白的结合模式，解析分子作用机制。
5. 优化筛选体系，适配不同药物溶剂与复杂样本体系。
6. 结合该筛选模型研究疟原虫磷酸盐代谢通路，发掘更多潜在药物靶点。
7. 测试抑制剂与现有抗疟药物的联合用药效果，探索协同治疗方案。
测量的数据及研究意义
1 测定不同钠离子浓度、pH条件下PfPiT与酵母Pho84的磷酸盐摄取动力学参数及米氏常数，数据来自图1、表1。研究意义：验证PfPiT属于钠依赖性磷酸盐转运蛋白，明确其功能特征与原生状态一致，证明工程菌株可用于功能研究。
2 检测不同磷酸盐浓度、初始pH、氯化钠含量下工程酵母与对照菌株的生长情况，数据来自图2、图3。研究意义：确定筛选体系最优培养条件与检测时长，建立标准化筛选方案。
3 测定膦甲酸钠对菌株生长及磷酸盐摄取的半数抑制浓度，数据来自图4、表2。研究意义：以阳性药物完成体系验证，证明该模型可准确筛选转运蛋白抑制剂。
4 对21种候选化合物进行初筛，统计各菌株生长抑制情况，数据来自图5。研究意义：初步筛选出两种特异性抑制PfPiT的候选抑制剂。
5 测定两种候选化合物的浓度梯度抑制效果与对应IC50值，数据来自图6、表2。研究意义：量化抑制剂活性，同时对比生长实验与放射性实验结果，分析差异成因。
结论
1 成功构建仅表达恶性疟原虫PfPiT的酿酒酵母工程菌株，该菌株生长完全依赖PfPiT介导的磷酸盐摄取，可用于靶点功能研究与药物筛选。
2 PfPiT转运活性受钠离子、pH显著调控，功能特性与疟原虫内天然蛋白保持一致，酵母异源表达体系可靠。
3 优化得到的22小时酵母生长筛选体系稳定性、重复性良好，符合高通量筛选要求，且操作简单、成本低。
4 筛选得到3-NPA和乙酸钾两种PfPiT特异性抑制剂，二者可有效抑制转运蛋白功能，具备成为抗疟先导化合物的潜力。
5 酵母生长抑制实验适合大规模初筛，放射性磷酸盐摄取实验可作为靶向活性复证手段，两种方法可搭配使用。
6 该筛选平台可用于挖掘靶向PfPiT的新型抗疟药物，为应对青蒿素耐药问题提供新的研发方向。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C微生物生长分析仪开展酵母生长相关检测。第一，设备采用100孔蜂窝板设计，支持高通量同步检测多组别、多浓度样本，适配条件摸索与批量筛选工作，大幅提升实验效率。第二，仪器每15分钟自动读取OD600数值，可连续长时间监测菌株完整生长周期，精准捕捉迟滞期、对数期变化，能够客观判定不同培养条件、药物浓度对酵母生长的影响。第三，设备统一温度、振荡、检测参数，实验环境高度一致，有效降低人为误差，保证多批次实验的数据重复性与可比性。第四，在体系优化阶段，依靠仪器连续监测数据确定最优pH、磷酸盐、氯化钠浓度以及标准检测时长，为筛选方案建立提供核心依据。第五，该设备可稳定完成酵母表型分析与药物活性初筛，是本筛选体系建立和运行的核心设备。