Genetic characterization and expression of leucocin B, a class IId bacteriocin from Leuconostoc carnosum
肉明串珠菌中IId类细菌素亮菌素B的基因特征与表达研究
来源：Research in Microbiology, Volume 166, 2015, Pages 494-503, doi:10.1016/j.resmic.2015.04.003
《微生物学研究》，第166卷，2015年，第494-503页，doi：10.1016/j.resmic.2015.04.003
摘要
肉明串珠菌4010是应用于真空包装肉类的保护性益生菌，该菌株除产生具有抗李斯特菌活性的IIa类细菌素亮菌素A、C外，还可合成IId类细菌素亮菌素B。亮菌素B抑菌谱较窄，仅作用于明串珠菌属和魏斯氏菌属。本研究在肉明串珠菌4010的质粒pLC4010-1上鉴定出两个新基因lebBI，分别编码亮菌素B前体（含双甘氨酸型前导肽）和假定免疫蛋白LebI，LebI含有三个跨膜结构域，与肠系膜菌素B105免疫蛋白同源性为55%。RT-PCR证实lebBI基因可在菌株内正常转录。研究利用对亮菌素B敏感、同时耐受亮菌素A和C的指示菌株，通过点斑法和SDS凝胶覆盖实验，证实肉明串珠菌4010能够分泌亮菌素B。此外，本研究将亮菌素A、B基因与分泌信号序列融合，在乳酸乳球菌中实现异源表达，并检测到活性细菌素的分泌。
关键词
肉明串珠菌；细菌素；亮菌素B；IId类细菌素；基因特征；异源表达；免疫蛋白；抑菌活性；最小抑菌浓度
研究目的
解析肉明串珠菌4010中亮菌素B的编码基因结构、序列特征及转录表达情况；鉴定亮菌素B对应的免疫蛋白基因；探究亮菌素B、A、C在乳酸乳球菌中的异源表达能力；测定三种亮菌素的抑菌谱与最小抑菌浓度；分析三类细菌素的作用差异与抗性机制。
研究思路
首先对肉明串珠菌4010质粒进行测序，定位亮菌素B及其免疫蛋白编码基因lebBI，开展序列比对与蛋白结构预测；利用RT-PCR验证lebBI的转录水平；筛选获得耐受亮菌素A、C但对亮菌素B敏感的突变菌株，以此作为特异性指示菌；采用硫酸铵沉淀法提取细菌素，结合点斑法、SDS-PAGE凝胶覆盖实验，验证野生菌株产亮菌素B的能力；构建携带亮菌素A、B重组表达质粒，导入乳酸乳球菌实现异源表达；借助芬兰Bioscreen C仪器测定不同细菌素对多种指示菌的最小抑菌浓度，对比三者抑菌活性与抑菌范围；最后分析细菌素抗性菌株的产生原因及作用机制。
研究亮点
1. 首次明确肉明串珠菌4010中亮菌素B的编码基因lebB和配套免疫基因lebI，解析基因排布与蛋白结构特征。
2. 成功筛选出对亮菌素A、C耐受但对亮菌素B敏感的特异性指示菌株，实现单一细菌素活性独立检测。
3. 证实亮菌素A、B、C可借助同一ABC转运系统完成分泌，拓宽细菌素分泌机制的研究认知。
4. 在乳酸乳球菌中实现亮菌素A、B功能性异源表达，为细菌素规模化制备提供技术基础。
5. 明确亮菌素B抑菌谱狭窄，且与亮菌素A、C作用靶点不同，细菌对三者的抗性机制存在差异。
6. 系统测定三种亮菌素的最小抑菌浓度，证实亮菌素C抑菌活性显著优于亮菌素A和B。
可延伸的方向
1. 深入解析LebI免疫蛋白的作用分子机制，阐明菌株自身耐受亮菌素B的原理。
2. 优化乳酸乳球菌表达体系，提升亮菌素B的异源表达产量。
3. 探究ABC转运蛋白识别不同亮菌素前导肽的分子机理。
4. 研究亮菌素复合使用的协同抑菌效果，开发复合型食品天然防腐剂。
5. 分析诱导条件、培养环境对肉明串珠菌产三种亮菌素的影响。
6. 继续筛选对亮菌素B产生抗性的菌株，解析其抗性演化规律。
7. 开展动物及食品应用试验，评估亮菌素B在肉类保鲜中的实际应用效果。
测量的数据及研究意义
1 分析lebBI基因序列、预测LebI蛋白跨膜结构并开展同源序列比对，数据来自图1、图2。研究意义：确定亮菌素B操纵子结构，明确免疫蛋白的分类与进化关系。
2 RT-PCR检测lebBI、lcnAB基因转录情况，数据来自图4。研究意义：证明lebBI在野生菌株中能够正常转录，确认亮菌素B可天然合成。
3 点斑抑菌实验检测不同菌株产物的抑菌圈，数据来自图3。研究意义：直观区分三种亮菌素的抑菌活性，验证异源表达产物具备生物活性。
4 SDS-PAGE结合凝胶覆盖实验分析细菌素分子量与活性，数据来自图5。研究意义：从蛋白层面证实肉明串珠菌4010可分泌亮菌素B，并区分三种细菌素条带。
5 测定不同指示菌的抑菌圈直径，数据来自表3。研究意义：全面对比亮菌素A、C的抑菌谱与活性强弱，明确亮菌素C抑菌能力更强。
6 利用仪器测定各细菌素的最小抑菌浓度。研究意义：量化三种亮菌素的抑菌效力，精准评价抑菌能力差异。
结论
1 肉明串珠菌4010的质粒pLC4010-1上存在lebBI双基因操纵子，分别编码亮菌素B前体和免疫蛋白LebI，该基因可正常转录表达。
2 亮菌素B属于IId类细菌素，抑菌范围狭窄，仅抑制明串珠菌属、魏斯氏菌属菌株，与IIa类亮菌素A、C作用靶点不同。
3 成功获得耐受亮菌素A、C的突变菌株，该菌株仍对亮菌素B敏感，可作为特异性指示菌用于亮菌素B活性检测。
4 亮菌素A、B、C可在乳酸乳球菌中实现异源分泌表达，且异源产物保留原有抑菌活性。
5 亮菌素C体外抑菌效果显著强于亮菌素A和B，三者无协同抑菌作用；细菌对亮菌素A、C的抗性不会交叉影响对亮菌素B的敏感性。
6 肉明串珠菌中三种亮菌素可共用一套ABC转运系统完成分泌，为多细菌素合成菌株的机制研究提供参考。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C微生物生长分析仪开展最小抑菌浓度测定实验。第一，该设备支持高通量微孔板检测，可同时批量处理多浓度梯度、多菌株样本，统一培养温度、振荡与检测条件，规避人工操作带来的误差，保证实验重复性。第二，仪器每小时自动检测菌液OD值，连续长时间监测菌株生长状态，能够精准判定菌株是否被完全抑制，严格依照标准确定最小抑菌浓度数值。第三，针对不同菌种设置差异化培养参数，可适配李斯特菌、明串珠菌等多种受试菌株的生长需求，数据通用性强。第四，大批量样本同步检测大幅提升实验效率，完成三种细菌素对不同菌株的MIC平行对比分析。第五，仪器输出的连续生长数据可直观反映细菌素浓度与抑菌效果的量效关系，为细菌素应用浓度筛选提供可靠依据。