全自动生长曲线分析仪

Stress-induced upregulation of the ubiquitin-relative Hub1 modulates pre-mRNA splicing and facilitates cadmium tolerance in Saccharomyces cerevisiae

应激诱导泛素同源蛋白Hub1上调调控前体mRNA剪接并提升酿酒镉耐受性

来源：BBA - Molecular Cell Research, Volume 1867, 2020, Article 118565, doi:10.1016/j.bbamcr.2019.118565

《生物化学与生物物理学报-分子细胞研究》，第1867卷，2020年，文章编号118565，doi：10.1016/j.bbamcr.2019.118565

摘要

前体mRNA剪接是真核生物基因表达的关键过程，DEAD-box RNA解旋酶参与调控剪接保真度。泛素同源蛋白Hub1可结合剪接关键因子Prp5并激活其ATP酶活性，过表达Hub1能提升剪接效率、放宽剪接位点限制，但其生理功能尚不明确。本研究发现，氧化应激、重金属镉胁迫可通过酵母AP1（Yap1）调控子在转录水平上调Hub1表达；镉胁迫下，上调的Hub1能够促进含非典型剪接位点内含子的剪接。Hub1并非酿酒酵母存活必需基因，但当金属硫蛋白介导的防御系统缺失时，Hub1对酵母镉耐受至关重要。同时，多种剪接因子突变菌株也表现出镉敏感表型，证实前体mRNA剪接过程参与酵母重金属胁迫应答。该研究表明，应激诱导的Hub1表达可通过调控特异性剪接重塑基因表达谱，帮助酵母抵御镉毒害。

关键词

Hub1蛋白；泛素同源蛋白；前体mRNA剪接；剪接因子；镉胁迫；氧化应激；Yap1转录因子；金属硫蛋白；酿酒酵母；细胞应激

研究目的

明确氧化、镉等胁迫条件下Hub1蛋白的表达调控机制；探究Hub1对前体mRNA剪接的调控作用；分析Hub1与金属硫蛋白在酵母镉耐受中的功能关联；验证剪接系统整体功能对重金属抗性的影响，解析剪接调控介导酵母重金属胁迫应答的分子机制。

研究思路

首先利用免疫印迹、实时荧光定量PCR检测不同胁迫、不同浓度镉处理下Hub1的蛋白与转录水平；通过基因敲除、启动子突变、β-半乳糖苷酶报告基因实验，确定调控Hub1的核心转录因子与作用元件；构建Hub1、金属硫蛋白CUP1单/双缺失菌株，结合平板点样、液体培养、存活实验分析菌株镉耐受性；借助RT-PCR检测不同菌株中典型基因的剪接效率，区分典型与非典型内含子的剪接差异；敲除多种核心剪接因子，验证剪接系统与镉耐受的关联性；全程使用Bioscreen仪器监测菌株生长状态，整合所有结果梳理作用通路。

研究亮点

1. 阐明镉、氧化胁迫下Hub1由Yap1为主、Yap2为辅的AP1调控子在转录水平激活，明确其上游调控通路。

2. 揭示Hub1的功能特异性，仅优先提升非典型剪接位点内含子的剪接效率，不影响常规内含子剪接。

3. 发现Hub1与金属硫蛋白存在功能互补关系，金属硫蛋白可掩盖Hub1缺失带来的镉敏感表型。

4. 证实整体剪接系统的完整性是酵母抵御镉胁迫的重要条件，拓展了细胞重金属耐受的分子机制研究方向。

5. 结合多种分子生物学与表型实验，从转录调控、RNA加工、细胞表型多层面完成机制解析。

可延伸的方向

1. 鉴定受Hub1调控、参与镉解毒的下游靶基因，明确具体的胁迫应答基因网络。

2. 探究Hub在动植物、其他真菌等真核生物中是否保守发挥重金属耐受功能。

3. 研究不同重金属、多种复合胁迫下Hub1的表达与剪接调控模式。

4. 解析Hub1与Prp5等剪接复合物互作的精细分子结构。

5. 改造Hub1相关通路，构建高重金属耐受性工程菌株。

6. 分析不同剪接因子在各类胁迫应答中的分工与协同作用。

7. 研究长期镉胁迫下Hub1及剪接系统的适应性演化规律。

测量的数据及研究意义

1 不同浓度镉、亚砷酸钠、过氧化氢处理后Hub1蛋白及mRNA表达量，数据来自图1。研究意义：证明氧化、重金属胁迫可显著上调Hub1，且表达量与胁迫浓度呈正相关。

2 Yap1、Yap2敲除菌株及启动子突变体的Hub1表达、报告基因活性数据，数据来自图2。研究意义：确定Yap1是调控Hub1转录的核心因子，YRE1为关键响应元件。

3 不同基因缺失菌株在镉环境下的生长、细胞存活数据，数据来自图3。研究意义：证实CUP1缺失后，Hub1缺失会导致酵母镉抗性大幅下降，二者存在功能互补。

4 典型、非典型内含子基因的剪接产物定量数据，数据来自图4。研究意义：明确Hub1仅特异性提升非典型剪接位点内含子的剪接效率。

5 多种剪接因子突变菌株的镉耐受表型数据，数据来自图5。研究意义：证明完整的剪接系统是酵母抵御镉胁迫的必要条件。

结论

1 镉、氧化等外界胁迫可通过酵母Yap1为主的AP1调控子，在转录水平显著上调Hub1蛋白表达。

2 Hub1不影响酿酒酵母正常生长，但在金属硫蛋白防御系统缺失时，成为酵母耐受镉胁迫的关键因子。

3 镉胁迫下，上调的Hub1能够特异性提升含非典型剪接位点内含子的剪接效率，常规内含子剪接不受影响。

4 剪接复合体核心因子发生突变后，酵母同样表现出镉敏感特征，证明前体mRNA剪接过程整体参与重金属应激反应。

5 应激诱导的Hub1通过调控特异性RNA剪接重塑基因表达模式，是酿酒酵母抵御镉毒害的重要分子机制。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

本研究使用**Bioscreen C微生物生长分析仪**开展菌株生长动态检测。第一，设备采用高通量微孔板体系，可同时设置对照组、不同镉浓度组、多种基因缺失菌株组，实现大批量样本同步检测。第二，仪器每15分钟检测600 nm吸光度，连续24 h记录完整生长曲线，精准反映菌株生长速率、生长延迟等表型差异。第三，仪器统一培养温度、振荡条件，消除人为操作误差，保证各组生长数据可横向对比。第四，依托连续监测的生长数据，直观量化Hub1、CUP1基因缺失对镉胁迫下菌株生长的抑制作用。第五，该设备获取的生长数据是评估菌株胁迫耐受性、验证基因功能的核心实验依据。