Conversion of levoglucosan and cellobiosan by Pseudomonas putida KT2440
恶臭假单胞菌KT2440对左旋葡聚糖和纤维聚糖的转化研究
来源：Metabolic Engineering Communications, Volume 3, 2016, Pages 24-29, doi:10.1016/j.meteno.2016.01.005
《代谢工程通讯》，第3卷，2016年，第24至29页，doi：10.1016/j.meteno.2016.01.005
摘要
生物质热解制备生物油会生成大量左旋葡聚糖与纤维聚糖，目前微生物利用纤维聚糖的机制尚不明确。本研究将左旋葡聚糖激酶基因导入恶臭假单胞菌KT2440，改造后的菌株可将左旋葡聚糖作为唯一碳源生长。研究证实糖苷水解酶GH1和GH3家族的β-葡萄糖苷酶均可水解纤维聚糖，生成左旋葡聚糖和葡萄糖。向工程菌体系中添加外源β-葡萄糖苷酶后，菌株能够利用纤维聚糖正常生长。该研究阐明了微生物协同利用左旋葡聚糖与纤维聚糖的代谢途径，为生物质热解产物的生物提质利用提供了重要依据。
关键词
恶臭假单胞菌KT2440；左旋葡聚糖；纤维聚糖；左旋葡聚糖激酶；β-葡萄糖苷酶；生物质热解；生物油；生物转化；微生物代谢；生物燃料
研究目的
构建可高效利用左旋葡聚糖的恶臭假单胞菌工程菌株；探究不同来源β-葡萄糖苷酶对纤维聚糖的水解能力；验证工程菌搭配β-葡萄糖苷酶后对纤维聚糖的利用效果；解析左旋葡聚糖、纤维聚糖的微生物代谢通路，为生物质热解产物生物加工建立技术基础。
研究思路
首先对来源于斯达氏油脂酵母的左旋葡聚糖激酶基因进行密码子优化，构建表达载体并通过同源重组整合至恶臭假单胞菌KT2440基因组，获得工程菌株FJPO3；利用芬兰Bioscreen C仪器测定菌株以葡萄糖、不同浓度左旋葡聚糖为碳源的生长曲线，结合HPLC分析底物消耗情况；采用尼罗红染色结合显微镜观察菌株合成中长链聚羟基烷酸酯的情况；选取四种分属GH1、GH3家族的β-葡萄糖苷酶，开展体外水解实验，通过HPLC检测纤维聚糖水解产物；最后将β-葡萄糖苷与工程菌联用，测定菌株以纤维聚糖为碳源的生长情况，评估整体转化效果。
研究亮点
1. 首次实现恶臭假单胞菌工程菌以高浓度左旋葡聚糖（最高60 g/L）为唯一碳源生长，底物耐受能力优异。
2. 证实多家族、不同微生物来源的β-葡萄糖苷酶均可水解纤维聚糖，明确其水解产物为左旋葡聚糖和葡萄糖。
3. 构建出可协同利用左旋葡聚糖与纤维聚糖的微生物转化体系，打通生物质热解糖组分的完整生物利用通路。
4. 验证工程菌利用左旋葡聚糖可合成高价值中长链聚羟基烷酸酯，拓展产物应用方向。
5. 研究体系简单易实现，适用于生物质热解产物的规模化生物提质加工。
可延伸的方向
1. 改造菌株使其自主表达并分泌β-葡萄糖苷酶，省去外源加酶步骤，简化工艺。
2. 探究热解生物油中抑制物对菌株生长与底物转化的影响，并开发脱毒技术。
3. 优化发酵条件，提升菌株对混合糖底物的转化效率与目标产物产量。
4. 拓展该菌株对生物质热解体系中其他脱水糖、寡糖的利用能力。
5. 开展发酵罐放大实验，验证工艺工业化应用潜力。
6. 结合代谢组学解析底物代谢网络，进一步改造提升菌株性能。
7. 研究该体系用于生物燃料、大宗化学品合成的可行性。
测量的数据及研究意义
1 工程菌分别以葡萄糖、左旋葡聚糖为碳源的生长曲线数据，数据来自图1A。研究意义：证明改造后的菌株可高效利用左旋葡聚糖，生长状态与利用葡萄糖的菌株相近。
2 不同浓度左旋葡聚糖的底物利用率数据，数据来自图1B。研究意义：证实菌株可耐受并利用最高60 g/L的左旋葡聚糖，底物适用浓度范围广。
3 细胞荧光显微观测结果，数据来自图1C。研究意义：明确工程菌利用左旋葡聚糖可合成中长链聚羟基烷酸酯，实现高附加值产物合成。
4 不同添加量β-葡萄糖苷酶对纤维聚糖的水解转化率数据，数据来自图2。研究意义：证明GH1、GH3家族多种β-葡萄糖苷酶均能有效水解纤维聚糖，确定水解产物组成。
5 不同底物浓度下纤维聚糖与纤维二糖的水解转化率数据，数据来自图3。研究意义：发现纤维聚糖相比纤维二糖更易出现底物抑制，为酶促反应浓度选择提供依据。
6 菌株在纤维二糖、纤维聚糖体系中的生长曲线与最大比生长速率数据，数据来自图4。研究意义：证实添加β-葡萄糖苷酶后，工程菌可利用纤维聚糖完成生长，完成双底物协同利用验证。
结论
1 导入左旋葡聚糖激酶基因的恶臭假单胞菌工程菌FJPO3，能够将左旋葡聚糖作为唯一碳源生长，且可耐受60 g/L的高浓度左旋葡聚糖。
2 GH1和GH3家族的多种β-葡萄糖苷酶均可水解纤维聚糖，将其分解为左旋葡聚糖和葡萄糖，水解效果受酶添加量与底物浓度影响，纤维聚糖更易产生底物抑制效应。
3 单独的原始菌株与工程菌均无法利用纤维聚糖，搭配外源β-葡萄糖苷酶后，工程菌可借助水解生成的左旋葡聚糖持续生长，实现纤维聚糖的生物转化。
4 工程菌利用左旋葡聚糖能够合成中长链聚羟基烷酸酯，说明该菌株可将生物质热解糖转化为高价值生物聚合物。
5 本研究建立的转化体系，实现了左旋葡聚糖、纤维聚糖两类主要生物质热解脱水糖的协同利用，为生物质热解-生物联合加工技术提供了可行方案。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用**芬兰Bioscreen C自动化微生物生长曲线分析仪**开展菌株生长检测。第一，设备搭载高通量蜂窝培养板，可同时设置葡萄糖、不同浓度左旋葡聚糖、纤维聚糖等多组实验组与平行样本，满足大批量生长试验需求。第二，仪器每15分钟自动检测420-580 nm光密度值，连续长时间记录完整生长曲线，能够精准计算最大比生长速率，定量评估菌株对不同碳源的利用能力。第三，设备统一温度、振荡等培养环境，消除人为操作误差，保证各组数据横向对比的准确性。第四，利用该仪器完成不同碳源、不同底物浓度下的生长对比，直观区分菌株生长差异，验证基因改造与外源酶添加的实际效果。第五，仪器获取的生长数据是评价菌株底物利用能力、筛选最优培养条件的核心依据，也为后续发酵工艺优化提供了基础数据支撑。