Control of D-lactic acid content in P(LA-3HB) copolymer in the yeast Saccharomyces cerevisiae using a synthetic gene expression system
利用合成基因表达系统调控酿酒酵母中P(LA-3HB)共聚物的D-乳酸含量
来源：Metabolic Engineering Communications, Volume 14, 2022, Article e00199, doi:10.1016/j.mec.2022.e00199
《代谢工程通讯》，第14卷，2022年，文章编号e00199，doi：10.1016/j.mec.2022.e00199
摘要
聚羟基烷酸酯（PHA）是可替代石化塑料的全生物基材料，单纯聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）力学性能存在短板，掺入其他单体可改善材料特性。本研究在酿酒酵母中改造多西环素调控的Tet-On合成表达系统，通过控制肠膜明串珠菌来源D-乳酸脱氢酶基因（ldhA）的表达水平，实现胞内D-乳酸单体合成的精准调控，该调控方式不依赖培养条件。实验发现培养基中多西环素浓度与ldhA表达量、D-乳酸产量、胞内聚D-乳酸（PDLA）积累量以及P(LA-3HB)共聚物中D-乳酸占比呈正相关。借助该系统可将P(LA-3HB)共聚物的D-乳酸摩尔占比在6%至93%之间线性调节。本研究获得的PDLA产量达到细胞干重的5.6%，P(LA-3HB)共聚物产量达到细胞干重的19%，分别是以往酵母体系报道产量的2倍和5倍以上。同时对比两种PHA合酶，结果显示phaC1437Ps6-19合成的共聚物D-乳酸占比更低、分子量更高。
关键词
合成表达系统；Tet-On系统；多西环素；酿酒酵母；D-乳酸脱氢酶；聚羟基烷酸酯；P(LA-3HB)共聚物；PHA合酶；生物基聚合物；代谢工程
研究目的
构建基于Tet-On的可控基因表达体系，在酿酒酵母中实现ldhA基因表达的梯度调控；探究基因表达水平对D乳酸合成、PDLA及P(LA-3HB)共聚物合成的影响；对比两种不同PHA合酶的催化性能与基因拷贝数对聚合物产量、分子量的作用；明确该调控体系的应用潜力，优化酵母合成PHA类生物聚合物的工艺。
研究思路
首先利用CRISPR/Cas9与EasyClone技术对酿酒酵母进行基因编辑，敲除内源D-乳酸脱氢酶基因，整合Tet-On转录因子、ldhA基因以及PHA合成相关通路基因，构建系列工程菌株；设置不同浓度多西环素，借助芬兰Bioscreen设备监测菌株生长情况，结合qPCR检测ldhA转录水平；采用气相色谱、尺寸排阻色谱等技术，测定D乳酸产量、聚合物含量、单体比例与分子量；对比两种PHA合酶以及不同基因拷贝数对产物的影响；最后综合数据分析基因调控规律、酶学差异与合成效果。
研究亮点
1. 搭建多西环素诱导的Tet-On可控表达系统，可线性调控P(LA-3HB)共聚物中D-乳酸摩尔占比，调控范围覆盖6%至93%，调控精度高。
2. 大幅提升酵母中PDLA与P(LA-3HB)的合成产量，产量显著优于以往同类研究。
3. 证实两种改造型PHA合酶功能存在差异，为聚合物分子量与单体比例定向调控提供酶学选择依据。
4. 依靠基因表达调控实现聚合物组分改造，无需改变培养条件或外源添加单体，工艺简便通用性强。
5. 明确该合成表达系统可拓展应用于PHA合成通路其他基因的调控，平台拓展性良好。
可延伸的方向
1. 优化Tet-On系统，降低本底表达，进一步拓宽共聚物单体比例的调控范围。
2. 探究不同碳源、培养条件对工程菌株聚合物合成效率的影响。
3. 结合转录组、代谢组解析基因调控下的胞内代谢流变化规律。
4. 对PHA合酶进行分子改造，进一步提升聚合物分子量与合成效率。
5. 将该可控表达系统应用于其他微生物及其他生物基聚合物的合成调控。
6. 开展聚合物材料力学、热学性能测试，关联单体比例与材料特性。
7. 进行发酵罐放大培养试验，验证工艺工业化应用可行性。
测量的数据及研究意义
1 不同多西环素浓度下酵母生长曲线、ldhA转录水平数据，数据来自图1。研究意义：明确多西环素浓度可梯度调控ldhA表达，同时确定该诱导剂对菌株生长影响较小。
2 不同诱导条件下胞外D乳酸产量、胞内PDLA积累量数据，数据来自图1、图2。研究意义：证实ldhA表达量与D乳酸、PDLA合成呈正相关，明确最佳诱导浓度。
3 不同PHA合酶、不同基因拷贝数对应的菌株生长、乳酸产量、PDLA含量数据，数据来自图3。研究意义：对比得出两种合酶的性能差异，确定合适的基因拷贝数以提升产物产量。
4 P(LA-3HB)共聚物的单体比例、总产量、发酵参数数据，数据来自图4、表3。研究意义：验证该系统可大范围线性调控共聚物组分，同时实现聚合物高产。
5 聚合物分子量、分散度检测数据，数据来自表4。研究意义：明确两种合酶合成产物的分子量差异，建立酶型与聚合物分子特性的对应关系。
结论
1 改造后的Tet-On表达系统可通过调节多西环素浓度精准控制ldhA基因表达，进而线性调控P(LA-3HB)共聚物中D-乳酸摩尔占比，调控区间为6 mol%~93 mol%。
2 该调控体系下酿酒酵母合成PDLA、P(LA-3HB)的产量大幅提升，产量分别达到细胞干重5.6%和19%，远超此前酵母菌株的合成水平。
3 phaC1437Ps6-19合酶合成的共聚物D-乳酸占比更低、分子量更高，phaC1Pre合酶对应的共聚物D-乳酸含量更高，两种酶功能特性区分明显。
4 增加PHA合酶基因拷贝数并未持续提升聚合物产量，单拷贝与三拷贝菌株综合表现更优。
5 本套基因调控方案无需改动培养体系，仅通过诱导剂即可定向改造生物聚合物组分，可为定制型生物基PHA材料的合成提供高效技术手段。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用**Bioscreen C微生物生长分析仪**开展酵母生长监测实验。第一，设备采用高通量微孔板模式，可同时检测0、1、5、10 mg/L等不同多西环素浓度组的菌株，批量完成多组平行试验，提升检测效率。第二，仪器每10分钟自动检测600 nm光密度值，连续记录完整生长曲线，能够精准计算生长速率、分析诱导剂对菌体生长的影响。第三，设备统一控温、振荡等培养条件，消除人为操作误差，保证不同实验组数据横向对比的可靠性。第四，通过生长数据筛选出对菌株生长影响最小的诱导浓度范围，为后续发酵与产物合成实验奠定基础。第五，该设备获取的生长数据，是评价诱导系统安全性、筛选最优实验条件的核心依据。