A CRISPR Interference Screen of Essential Genes Reveals that Proteasome Regulation Dictates Acetic Acid Tolerance
利用CRISPR干扰技术筛选必需基因揭示蛋白酶体调控决定酵母菌的乙酸耐受性
来源：mSystems, Volume 6, Issue 4, July/August 2021, Article number e00418-21, doi:10.1128/mSystems.00418-21
《mSystems》，第6卷第4期，2021年7-8月，文章编号e00418-21，doi：10.1128/mSystems.00418-21
摘要
CRISPR干扰（CRISPRi）是研究不同培养条件下细胞生理、筛选必需基因表达变化的有力工具。本研究利用包含九千余株菌株的酿酒酵母CRISPRi文库，在添加乙酸的培养基中开展高通量筛选。乙酸是木质纤维素生物质工业转化过程中产生的抑制物，提升酵母菌的乙酸耐受性对生物炼制领域的细胞工厂应用至关重要。研究借助高通量Scan-o-matic平台对每株菌株单独表型分析，结果发现，囊泡形成、细胞器转运相关基因被CRISPRi抑制后，酵母在乙酸胁迫下生长严重受阻；而下调26S蛋白酶体19S调节亚基编码基因，可显著提升酵母乙酸耐受性。推测该现象是由于19S亚基表达降低后，细胞内不依赖ATP的20S核心颗粒含量上升，实现ATP的回收利用。本研究首次利用高分辨率CRISPRi文库解析必需基因功能，阐明了蛋白酶体调控与酵母乙酸耐受的关联，为工业酵母的生物工程改造提供了新方向。
关键词
CRISPR干扰；酿酒酵母；必需基因；乙酸耐受性；蛋白酶体；囊泡转运；氧化应激；高通量筛选；基因表达调控
研究目的
解析酿酒酵母中参与乙酸胁迫应答的必需基因与呼吸生长必需基因；
明确囊泡转运、蛋白酶体相关基因在乙酸耐受中的功能与作用机制；
探究蛋白酶体不同亚基对酵母乙酸抗性的差异化影响；
阐释乙酸胁迫下ATP代谢、蛋白质降解与细胞耐受的内在联系；
为改造高耐受工业酵母菌株、优化木质纤维素生物转化工艺提供理论依据。
研究思路
首先采用Scan-o-matic高通量表型平台，对覆盖绝大多数酵母必需基因的CRISPRi文库进行筛选，分别检测基础培养基、含乙酸培养基中菌株生长表型，筛选出乙酸敏感株与耐受株；
其次通过基因本体富集分析，锁定差异显著的囊泡转运、蛋白酶体相关基因；
然后选取代表性菌株，在液体培养体系中复现表型，并利用实时荧光定量PCR验证目标基因的转录抑制效果；
接着重点研究26S蛋白酶体各亚基基因，区分19S调节颗粒、20S核心颗粒对乙酸耐受性的不同作用；
最后结合乙酸胁迫下氧化应激、ATP消耗、蛋白质降解的生理特征，构建蛋白酶体调控乙酸耐受的分子模型，阐释作用机理。
研究亮点
1. 首次利用全基因组CRISPRi文库针对酵母必需基因开展乙酸耐受高通量筛选，弥补传统敲除文库无法研究致死必需基因的缺陷。
2. 证实囊泡形成、细胞器转运系统是酵母抵御乙酸胁迫的关键，该系统受损会大幅降低菌株存活能力。
3. 发现下调26S蛋白酶体19S调节亚基可提升乙酸耐受性，而抑制20S核心颗粒会加剧菌株敏感，二者功能截然相反。
4. 提出全新耐受机制：19S亚基下调使20S核心颗粒富集，依靠非ATP依赖的蛋白降解途径节约能量，缓解乙酸造成的ATP匮乏与氧化损伤。
5. 明确YPI1、GLC7基因通过调控糖原代谢参与乙酸胁迫应答，丰富了酵母抗逆调控网络。
6. 采用固态、液态两种培养体系联合验证，结合多组学与表型数据，结论可靠性高，具备工业菌株改造的实际指导价值。
可延伸的方向
1. 靶向蛋白酶体19S亚基开展基因编辑，构建高乙酸耐受工程酵母，测试其木质纤维素发酵性能。
2. 深入解析乙酸胁迫下囊泡转运通路受损引发细胞损伤的具体分子机制。
3. 探究不同有机酸、胁迫条件下，蛋白酶体调控通路的通用性与特异性。
4. 研究gRNA设计、抑制强度对必需基因表型的影响，优化CRISPRi筛选体系。
5. 结合代谢组、蛋白组，全面解析乙酸胁迫下酵母全局代谢变化。
6. 联合多种抗逆靶点进行多基因改造，进一步提升酵母综合抗逆能力。
7. 探究该调控机制在其他工业微生物中的保守性，拓展应用范围。
测量的数据及研究意义
1 测定CRISPRi文库菌株在基础培养基、150 mM乙酸固体培养基中的世代时间等生长参数，数据来自图1、图2。研究意义：大规模筛选出乙酸敏感、耐受菌株，初步定位关键功能基因，完成初筛工作。
2 基因本体富集分析敏感株与耐受株的基因功能分类，数据来自图5。研究意义：明确囊泡转运、蛋白酶体是乙酸应答的两大核心功能模块，锁定后续研究方向。
3 液体培养体系验证代表性菌株生长表型，检测世代时间、生物量、迟滞期，数据来自图7。研究意义：验证固体筛选结果，确认表型稳定性，量化基因抑制对生长的影响程度。
4 qPCR检测目标基因转录水平，分析基因抑制程度与表型的相关性，数据来自图4。研究意义：证实不同gRNA的抑制效率存在差异，且基因表达量与乙酸耐受表型直接相关。
5 统计蛋白酶体各亚基基因被抑制后的菌株表型，数据来自表2、图6。研究意义：区分19S调节颗粒、20S核心颗粒的不同功能，明确两类亚基对乙酸耐受性的相反作用。
6 测定不同诱导剂浓度下菌株生长情况，优化CRISPRi系统工作条件。研究意义：确定最优实验参数，保障后续筛选与验证实验的稳定性。
结论
1 囊泡形成、内质网-高尔基体转运、液泡分选等细胞器转运相关必需基因对酵母乙酸耐受至关重要，这类基因表达受抑制会造成菌株显著敏感。
2 26S蛋白酶体不同结构亚基在乙酸胁迫中功能分化明显，抑制19S调节颗粒亚基可提升耐受性，抑制20S核心颗粒则会加剧损伤。
3 下调19S亚基会使细胞内20S核心颗粒富集，依靠不消耗ATP的氧化蛋白降解途径，缓解乙酸引发的ATP短缺与氧化应激，这是核心耐受机制。
4 YPI1与GLC7通过调控糖原代谢参与乙酸应答，二者表达改变会影响酵母抗逆能力。
5 CRISPRi的抑制效果依赖向导RNA序列，必需基因的表达微调即可显著改变酵母抗逆表型，为精准改造工业菌株提供可行思路。
6 本研究建立的必需基因CRISPRi筛选体系，可推广用于微生物各类胁迫抗性的挖掘研究。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C微生物生长分析仪，开展诱导剂浓度梯度测试、菌株液体生长验证等实验。第一，该设备支持高通量微孔板自动化检测，可长时间连续监测菌液OD值，完整记录菌株迟滞期、对数期、稳定期等全生长阶段，精准获取世代时间、生物量等核心参数。第二，实验设置多组浓度梯度与生物学重复，仪器统一培养温度、振荡、通气条件，最大程度消除人为误差，保证数据重复性与对比性。第三，用于优化CRISPRi诱导剂使用浓度，确定最佳实验条件，为整个筛选体系奠定基础。第四，对初筛得到的目标菌株进行液体培养复证，衔接固体平板表型结果，交叉验证乙酸敏感/耐受表型的真实性。第五，可同步分析乙酸浓度对菌株生长的影响，直观反映胁迫强度与菌株生理状态的关联，助力解析抗逆生理机制。第六，该设备适配酵母等真菌的长时间胁迫培养实验，是微生物表型筛选、抗逆研究的标准化工具。