Signaling pathways contributing to the transcriptional response to alkalinization in Komagataella phaffii: role of the transcription factors Crz1 and Rim101
巴斯德毕赤酵母应对碱化的转录响应信号通路：转录因子Crz1与Rim101的作用
来源：Scientific Reports 2025, Volume 15, Article number: 35841
《科学报告》，2025年，第15卷，文章编号35841
摘要
本研究鉴定了工业酵母Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）中响应碱性pH的两个关键转录因子Crz1和Rim101。利用CRISPR/Cas9构建单突变与双突变株，发现crz1缺失株对Ca²⁺高度敏感、对SDS耐受性增强，rim101缺失株对Na⁺、Li⁺、碱性pH与SDS高度敏感。转录组显示Rim101调控55%的碱性响应基因，Crz1仅调控11%，二者共同调控38个基因。Crz1主要调控液泡钙ATP酶PMC1，Rim101调控钠ATP酶ENA2、磷酸盐转运蛋白及铁稳态相关基因。蛋白质组验证了上述调控效应。Rim101是毕赤酵母碱性响应的核心转录因子，二者共同介导近60%的碱性转录响应。
关键词
毕赤酵母；碱性应激；转录调控；Crz1；Rim101；钙稳态；钠转运；磷酸盐代谢
研究目的
阐明毕赤酵母在碱性环境下的转录响应信号通路，明确转录因子Crz1和Rim101的功能、调控靶点与分工，为构建耐碱、外源蛋白高效表达的工程菌株提供理论基础。
研究思路
通过序列比对鉴定Crz1和Rim101同源基因；利用CRISPR/Cas9构建单、双突变株；进行表型芯片分析（离子、pH、SDS耐受）；开展转录组与蛋白质组测序，解析基因与蛋白层面的调控网络；验证关键靶基因，明确两个转录因子的调控分工。
研究亮点
1 首次在毕赤酵母中系统解析Crz1与Rim101在碱性应激中的功能与调控网络。
2 证明Rim101主导碱性转录响应（调控55%基因），远强于Crz1（调控11%基因）。
3 揭示二者分工：Crz1负责钙稳态，Rim101负责钠、磷、铁稳态与碱耐受。
4 转录组与蛋白质组联合验证，为碱性启动子工程化提供精准靶点。
可延伸的方向
1 构建Rim101超强激活型突变体，提升毕赤酵母碱耐受性与碱性启动子效率。
2 开发完全不依赖甲醇的碱性诱导表达系统。
3 挖掘Crz1与Rim101之外的剩余40%碱性响应基因与通路。
4 将调控机制应用于提高工业发酵耐碱性与蛋白产量。
5 解析Rim101通过Nrg1介导的间接调控网络。
测量的数据及研究意义
1 离子与pH胁迫生长数据：不同浓度CaCl₂、NaCl、LiCl、pH及SDS下的生长OD值（图2A、B），证明crz1对Ca²⁺敏感，rim101对Na⁺、Li⁺、碱、SDS敏感。
2 转录组差异基因数据：野生型与突变株在碱诱导15/30/60 min的差异表达基因（图3、5、6），证明Rim101调控55%碱性响应基因，Crz1调控11%。
3 关键基因表达数据：PMC1、ENA2、PHO89、PHO84、铁转运基因等mRNA水平（图7），证明Crz1调控PMC1，Rim101调控ENA2、PHO89、PHO84及金属稳态基因。
4 蛋白质组差异数据：碱处理3h后蛋白丰度变化（图8、9），在蛋白水平验证转运蛋白与代谢酶的调控效应。
结论
1 Crz1和Rim101是毕赤酵母碱性应激的核心转录因子，功能分工明确。
2 Crz1主要维持钙稳态，调控液泡钙ATP酶PMC1。
3 Rim101主导碱适应，调控ENA2钠泵、磷酸盐转运、铁/锌稳态等。
4 Rim101控制55%的碱性响应基因，Crz1控制11%，二者共同覆盖近60%。
5 Rim101的作用远大于Crz1，是毕赤酵母耐碱的关键调控因子。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen C全自动生长分析仪在 honeycomb 微孔板中实时监测OD₆₀₀，获得高重复性、高通量的生长曲线；精准定量野生型、crz1Δ、rim101Δ、双突变株在不同离子、pH、SDS条件下的生长速率、延滞期与最终生物量，客观反映突变株的敏感表型，为“Crz1调控钙稳态、Rim101调控钠/碱/SDS耐受”提供关键、定量、标准化的表型证据，是本研究表型结论的核心支撑。