全自动生长曲线分析仪

In silico identification of gene targets to enhance C12 fatty acid production in Escherichia coli

计算机模拟识别可增强大肠杆菌C12脂肪酸合成的基因靶点

来源：Applied Microbiology and Biotechnology 2025, Volume 109, 116

《应用微生物学与生物技术》，2025年，第109卷，文章编号116

摘要

本研究利用约束建模与Optknock算法，在大肠杆菌全基因组代谢网络中筛选能提高C12脂肪酸产量的基因敲除靶点，最终鉴定出9个候选基因，涉及回补反应、氨基酸合成、碳代谢与辅因子平衡。通过构建单基因与组合缺失突变株进行体内验证，三缺失突变株ΔmaeB Δndk ΔpykA的C12脂肪酸产量达到6.7 mg/L，较原始菌株提升7.5倍。研究证明模型引导的代谢工程可高效定向优化菌株，为微生物合成C12脂肪酸提供新策略与靶点。

关键词

模型引导代谢工程；Optknock；大肠杆菌；月桂酸；C12脂肪酸；油脂化学品

研究目的

利用计算机模拟筛选可增强大肠杆菌C12脂肪酸合成的基因敲除靶点，并通过实验验证有效性，建立高效产C12脂肪酸的工程菌株。

研究思路

基于iML1515全基因组代谢模型，通过约束建模与Optknock算法预测有益基因敲除靶点；构建单基因与多基因组合缺失突变株；在表达外源硫酯酶BTE的基础上，测定不同培养条件下的生长与C12脂肪酸产量；验证模拟预测结果并解析最佳高产组合。

研究亮点

1 首次通过计算机模拟精准定位非直观基因靶点，实现C12脂肪酸产量7.5倍提升。

2 系统阐明maeB、ndk、pykA等基因通过能量与碳通量重分配促进脂肪酸合成。

3 揭示葡萄糖调控C12脂肪酸饱和度的关键规律，为定向生产不饱和产物提供依据。

4 建立“模拟预测—实验验证—组合优化”的高效菌株改造流程。

可延伸的方向

1 将 identified 靶点组合应用于工业大肠杆菌菌株，进一步提升产量至克级水平。

2 结合过表达策略与敲除策略，强化前体供应与还原力供给。

3 探究不同培养模式（补料分批发酵）对产量与饱和度的调控作用。

4 拓展模型模拟至C8、C10等其他中链脂肪酸生产菌株设计。

5 结合转录组与代谢组解析高产突变株的全局代谢变化机制。

测量的数据及研究意义

1 诱导剂浓度优化数据：不同无水四环素浓度下C12产量（图3A、B），确定100 ng/mL为最优诱导条件，保证BTE高效表达。

2 生长曲线OD600数据：野生型与突变株在LB及葡萄糖条件下的生长动态，评估基因缺失对生长的影响，排除严重生长缺陷。

3 脂肪酸定量数据：各突变株总脂肪酸与C12脂肪酸含量（图4、5），验证靶点有效性，确认ΔmaeB Δndk ΔpykA为最优组合。

4 代谢通量预测数据：模型模拟的FA120ACPHi通量与生长速率（表2），为靶点选择提供理论依据，提高实验效率。

结论

1 利用计算机模拟成功鉴定9个可提升C12脂肪酸产量的基因敲除靶点。

2 三基因缺失株ΔmaeB Δndk ΔpykA可使C12脂肪酸产量提升7.5倍，达6.7 mg/L。

3 葡萄糖添加提高总脂肪酸产量，但降低不饱和C12比例。

4 模型引导的代谢工程是优化微生物脂肪酸合成的高效可靠方法。

使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义

使用Bioscreen C全自动生长分析仪实时监测野生型与各基因缺失突变株的OD600吸光度，获得连续、高精度的生长曲线；精准测定不同菌株的生长速率、最大OD值与延滞期，客观评估基因敲除对菌株生长的影响，排除因生长严重受损导致产量失真的情况，为高产菌株筛选提供可靠、标准化的生长表型数据，是验证代谢工程改造安全性与有效性的关键依据。