The yxiD gene from Bacillus subtilis 6633 encodes a polymorphic toxin with tRNase activity and is neutralized by the cognate immunity protein YxxD
枯草芽孢杆菌6633的yxiD基因编码一种具有tRNase活性的多态毒素并可被同源免疫蛋白YxxD中和
来源：Nucleic Acids Research 2025, Volume 53, gkaf1321
《核酸研究》，2025年，第53卷，文章编号gkaf1321
摘要
本研究对枯草芽孢杆菌6633的YxiD‑YxxD系统进行结构与功能解析，证实其为多态毒素‑免疫蛋白对。YxiD的C端结构域YxiDCTD具有金属离子依赖性tRNase活性，可切割多种tRNA并下调细胞壁合成等关键基因，导致细菌生长抑制与死亡；其同源免疫蛋白YxxD通过1:1高亲和力结合YxiDCTD，空间封闭毒素活性中心从而中和毒性。研究解析了1.7 Å分辨率的YxiDCTD‑YxxD复合物晶体结构，揭示毒素采用BECR折叠，明确了活性位点与底物识别机制，为理解革兰氏阳性菌多态毒素的作用与免疫中和机制提供了分子基础。
关键词
多态毒素；tRNase；YxiD；YxxD；毒素‑免疫系统；枯草芽孢杆菌；BECR折叠
研究目的
阐明枯草芽孢杆菌6633中YxiD的毒素活性类型、分子靶点与作用机制，解析YxxD中和YxiD毒性的结构基础，明确该多态毒素系统在细菌竞争中的功能。
研究思路
鉴定YxiD‑YxxD为候选毒素‑免疫基因对；在大肠杆菌中异源表达并检测生长表型；解析YxiDCTD‑YxxD复合物晶体结构；通过ITC、SEC测定结合亲和力与化学计量比；利用RNA‑seq、tRNA切割实验确定毒素分子靶点；通过突变与功能实验验证活性位点与底物结合关键残基；明确免疫蛋白的中和机制。
研究亮点
1 首次解析枯草芽孢杆菌YxiDCTD‑YxxD复合物的高分辨率晶体结构，揭示BECR折叠的毒素结构。
2 证实YxiD是广谱金属依赖性tRNase，可切割多种细菌tRNA并引发全局转录重编程。
3 阐明YxxD通过1:1高亲和力结合封闭活性中心实现免疫中和的分子机制。
4 发现YxiD跨物种切割tRNA，提示其在微生物群落竞争中具有广泛作用。
可延伸的方向
1 探究YxiD通过VII型分泌系统的分泌与递送机制。
2 开发基于YxiD毒素的新型抗菌肽或靶向杀菌工具。
3 研究YxiD识别tRNA底物的结构决定因素。
4 分析更多枯草芽孢杆菌菌株中YxiD家族毒素的功能多样性。
5 探索毒素‑免疫系统对生物膜内菌群竞争的影响。
测量的数据及研究意义
1 生长曲线与OD600数据：诱导表达YxiDCTD后细菌生长显著受抑，共表达YxxD可恢复生长（图1C），直接证明YxiD的毒性与YxxD的免疫功能。
2 梯度稀释点样与CFU数据：YxiDCTD表达使活菌数下降约4.6个数量级（图1D、E），定量验证毒素的强杀菌活性。
3 复合物晶体结构数据：1.7 Å分辨率结构，YxiDCTD的BECR折叠、YxxD的Sm‑like折叠、互作界面（图2、表1），揭示毒素与免疫蛋白的结合模式。
4 ITC与SEC数据：YxiDCTD与YxxD以1:1结合，KD≈9.4 nM（图3），证明形成高亲和力稳定复合物。
5 RNA‑seq数据：YxiD表达导致187个基因差异表达，34个基因下调包括细胞壁合成关键基因（图4B、C），阐明毒素致死的转录调控机制。
6 tRNA切割数据：YxiDCTD在Mg2+存在下特异性切割多种tRNA（图4E），确定其为tRNase。
7 突变体功能数据：His528、His521、Lys446等突变使毒性与酶活丧失（图5），鉴定活性与底物结合关键残基。
8 TEM数据：YxiD表达造成细菌形态破坏、膜损伤（图4A），直观展示毒素的细胞损伤效应。
结论
1 YxiD‑YxxD是枯草芽孢杆菌6633中功能性多态毒素‑免疫蛋白对。
2 YxiD的C端结构域是金属离子依赖性tRNase，通过切割tRNA、抑制翻译、下调细胞壁合成基因发挥毒性。
3 YxxD以1:1高亲和力结合YxiDCTD，空间封闭活性中心从而中和毒性。
4 YxiD采用典型的BECR核糖核酸酶折叠，活性中心由保守组氨酸残基构成。
5 该毒素系统通过靶向tRNA介导细菌间竞争，具有跨物种作用潜力。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen C全自动生长分析系统实时、高通量、高精度测定细菌在诱导表达毒素、免疫蛋白及突变体后的OD600变化，获得连续、标准化的生长曲线；该数据客观、定量地证明单独表达YxiDCTD会显著抑制细菌生长，共表达YxxD可完全恢复生长，活性位点突变体则失去毒性，为判定YxiD的毒性、YxxD的免疫功能以及关键残基的必要性提供了可重复、高说服力的核心表型证据，是本研究毒素功能验证的关键实验依据。