Development of an endogenous type I-E CRISPR-Cas-based gene editing tool for Halomonas nigrificans X339: Applications in enhancing poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production
基于内源性I-E型CRISPR‑Cas系统开发黑色单胞菌X339基因编辑工具及其在提升聚羟基丁酸戊酸酯产量中的应用
来源：Chemical Engineering Journal 2025, Volume 520, 166147
《化学工程杂志》，2025年，第520卷，文章编号166147
摘要
本研究以嗜碱嗜盐菌黑色单胞菌X339为对象，首次开发基于其内源性I‑E型CRISPR‑Cas系统的单质粒基因编辑工具，实现高效精准基因敲除。利用该工具敲除丙酸降解关键基因prpC，使丙酸转化为3‑羟基戊酸的效率从1.8%提升至70.5%，但导致菌株耐丙酸能力下降。进一步敲除23.6 kb胞外多糖合成基因簇PS1，构建双突变株ΔPS1ΔprpC，恢复菌株耐受性，实现丙酸转化率100%、PHBV含量62.5%、3HV摩尔分数7.57%，为高效合成PHBV提供工程化底盘。
关键词
黑色单胞菌；CRISPR‑Cas基因编辑；内源性I‑E型；聚羟基丁酸戊酸酯；胞外多糖；丙酸代谢
研究目的
构建适用于黑色单胞菌X339的高效内源性CRISPR‑Cas基因编辑系统，通过代谢工程改造优化丙酸流向，提升PHBV合成效率与菌株性能。
研究思路
鉴定X339内源性I‑E型CRISPR‑Cas系统并确定PAM序列；构建含mini‑CRISPR、同源臂与sacB筛选标记的单质粒编辑工具；敲除prpC阻断丙酸降解通路；敲除PS1减少碳流消耗；解析突变株生长、丙酸耐受、PHBV产量与组分变化；结合转录组揭示耐受性恢复机制。
研究亮点
1 首次在黑色单胞菌X339中建立内源性I‑E型CRISPR‑Cas单质粒编辑系统，操作简便、效率高。
2 阐明prpC缺失可重定向丙酸代谢流向PHBV合成，但会降低丙酸耐受性。
3 发现敲除EPS基因簇PS1可恢复丙酸耐受并进一步提升PHBV积累。
4 获得丙酸转化率100%的工程菌株，实现PHBV高效合成。
可延伸的方向
1 利用该编辑工具对X339进行更多代谢途径改造，提升其他产物合成。
2 优化CRISPR系统实现基因定点插入、过表达与转录调控。
3 探究更多环境胁迫耐受相关基因，强化工业菌株鲁棒性。
4 结合合成生物学设计动态调控通路，自动平衡生长与产物合成。
5 将该编辑策略拓展至其他嗜盐单胞菌属菌株。
测量的数据及研究意义
1 抗生素敏感性数据：庆大霉素、四环素、氯霉素、新霉素的MIC值，确定适合的筛选抗生素与浓度，为编辑系统提供筛选基础。
2 生长曲线与OD600数据：不同丙酸浓度下野生型与突变株的生长动态（图4B、4C、6A），明确prpC缺失导致耐丙酸下降，PS1缺失可部分恢复耐受。
3 基因敲除验证数据：菌落PCR鉴定prpC与PS1敲除，证明编辑系统高效可靠。
4 发酵性能数据：细胞干重CDW、PHBV浓度与含量、3HV摩尔分数、丙酸消耗量与转化率（图6B‑6G），量化代谢改造效果，证明双突变株最优。
5 材料表征数据：FTIR、NMR、TGA、DSC、GPC（图7），确认合成产物为高纯度PHBV并明确其理化特性。
6 转录组数据：ΔPS1ΔprpC与ΔprpC的差异表达基因，揭示LPS合成上调与膜稳定性提升是耐受恢复的关键。
结论
1 成功构建基于内源性I‑E型CRISPR‑Cas的单质粒基因编辑工具，适用于黑色单胞菌X339的高效基因操作。
2 敲除prpC可阻断丙酸的甲基柠檬酸循环，大幅提高3HV前体供应，但会降低菌株对丙酸的耐受性。
3 敲除胞外多糖基因簇PS1可减少碳源分流，恢复丙酸耐受性，同时提高PHBV合成量。
4 双突变株ΔPS1ΔprpC实现100%丙酸转化率、62.5% PHBV含量与7.57%的3HV摩尔分数，综合性能优异。
5 该内源性CRISPR工具为嗜盐单胞菌的代谢工程与工业应用提供了强大平台。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen C全自动微生物生长分析仪高通量、高精度实时监测菌株在不同抗生素与丙酸浓度下的OD600值，获取连续生长曲线；该数据客观、定量地反映菌株的抗生素敏感性、生长速率、延滞期与平台期，精准区分野生型、ΔprpC、ΔPS1、ΔPS1ΔprpC的丙酸耐受差异，为基因功能验证、代谢工程效果评估提供标准化、可重复、高说服力的表型证据，是确定编辑策略有效性的核心实验依据。