A fiducial-assisted strategy compatible with resolving small MFS transporter structures in multiple conformations using cryo-EM
一种适用于冷冻电镜解析多构象小型MFS转运蛋白结构的基质辅助策略
来源：Nature Communications 2025, Volume 16, Article number 7
《自然·通讯》，2025年，第16卷，文章编号7
摘要
本研究开发了一种利用AlphaFold2在主要协助超家族（MFS）膜转运蛋白C端融合刚性BRIL结构域的通用策略，通过短聚丙氨酸连接肽实现跨膜螺旋刚性延伸。结合BRIL特异性Fab，从单一样品中解析出42kDa金黄色葡萄球菌NorA的4种构象（内向开放、内向闭塞、闭塞、外向开放），分辨率达2.56–3.25Å。该方法在GlpT、Bmr、Blt三种MFS转运蛋白中得到验证，适用于约50–75%的MFS家族蛋白。该策略无需靶向特异性结合剂，可稳定解析小型膜蛋白多构象结构，为转运机制研究提供通用工具。
关键词
冷冻电镜；MFS转运蛋白；BRIL融合；刚性连接；NorA；多构象解析；基质辅助；膜蛋白结构
研究目的
建立适用于小型MFS转运蛋白的冷冻电镜结构解析通用策略，解决分子量接近冷冻电镜尺寸下限、缺乏可识别特征导致的颗粒对齐与构象解析难题。
研究思路
利用AlphaFold2预测并截短MFS蛋白无序C端，将其最后一个跨膜螺旋与BRIL第一个螺旋通过聚丙氨酸刚性连接；结合BRIL特异性Fab增大有效分子量；对NorA进行多构象解析与功能验证；拓展至GlpT、Bmr、Blt验证通用性；生物信息学分析MFS家族适用性。
研究亮点
1 首创C端刚性螺旋延伸BRIL融合策略，无需靶向结合剂即可实现小型膜蛋白高分辨率解析。
2 单一样品同步解析NorA四种关键构象，完整覆盖转运周期。
3 通过AlphaFold2精准设计连接肽长度，避免空间冲突，大幅减少构建体筛选。
4 方法可扩展至约50–75%的MFS家族转运蛋白，通用性强。
5 融合蛋白不影响转运功能，结构解析更接近天然状态。
可延伸的方向
1 将该策略应用于GPCR、离子通道等其他小型膜蛋白的冷冻电镜解析。
2 优化连接肽与刚性标签，进一步提升分辨率与构象捕捉能力。
3 结合底物、抑制剂共孵育，解析MFS转运蛋白的底物结合与抑制机制。
4 开发自动化连接肽设计软件，实现膜蛋白融合构建体高通量设计。
5 拓展至真核来源MFS转运蛋白，揭示人类疾病相关突变机制。
测量的数据及研究意义
1 NorA-BRIL融合蛋白SEC结合实验数据（图2a、b；图7a–c），证明融合蛋白与BAG2稳定结合，复合物均一。
2 冷冻电镜2D分类与3D重构数据（图2c–f；图7d–i），验证融合策略实现良好颗粒对齐与连续密度。
3 NorA四种构象冷冻电镜图谱与分辨率数据（图3、4），实现2.56–3.25Å高分辨率多构象解析。
4 生长抑制实验OD600数据，证明NorA-BRIL融合蛋白保持外排功能，不影响活性。
5 MFS家族1118个蛋白C端结构统计数据（图6），评估方法适用性覆盖50–75%家族成员。
6 融合蛋白模型与冷冻电镜密度叠加数据（图1c、图2e、f），验证AlphaFold2预测准确性。
结论
1 刚性C端BRIL融合策略可有效突破冷冻电镜小型蛋白尺寸限制，实现高分辨率结构解析。
2 聚丙氨酸连接肽形成跨膜螺旋连续延伸，保证标签与转运蛋白刚性相对取向。
3 该方法可从单一样品中捕获并区分MFS转运蛋白的多个功能构象。
4 设计流程标准化，仅需AlphaFold2预测即可高效获得最优构建体。
5 该策略是解析小型膜蛋白结构与动态构象的通用、高效、可靠新工具。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen Pro C全自动生长分析仪在30℃下连续振荡培养，每15分钟自动检测OD600，精准监测表达NorA、NorA-BRIL3A及失活突变体的大肠杆菌在不同诺氟沙星浓度下的生长抑制曲线；客观定量NorA外排功能，证实BRIL融合不影响转运蛋白活性，排除融合标签对蛋白功能的干扰，为结构解析结果的生物学相关性提供关键、无偏差的功能验证数据。