全自动生长曲线分析仪

Reductive activation of the disulfide-containing antibiotic thiolutin is mediated by both bacillithiol and FAD-dependent disulfide reductases

含二硫键的抗生素硫柳素的还原活化由杆菌硫醇及FAD依赖性二硫还原酶共同介导

来源：Journal of Bacteriology, Volume 207, Issue 7, July 2025

《细菌学杂志》，2025年7月，第207卷，第7期

摘要

金属离子对生命普遍必需，是代谢关键酶的必要组成。金属酶依赖金属摄取与转运通路完成金属负载。许多微生物产生天然产物作为金属螯合剂，用于自身营养或作为抗菌物质。宿主免疫细胞会通过螯合金属离子限制细菌生长，即营养免疫。细胞通过激活通路应对金属缺乏，优先将金属输送至最关键的酶。二硫吡咯烷酮类天然产物是前药，在细胞内被还原生成强效的含二硫醇锌螯合剂。本研究在枯草芽孢杆菌中鉴定出激活二硫吡咯烷酮类抗生素硫柳素的细胞还原剂，包括杆菌硫醇以及FAD依赖性氧化还原酶TrxB和AhpF。遗传学研究显示，Spx转录因子缺失会增强硫柳素抗性，这与Spx已知的功能一致，即转录激活硫氧还蛋白还原酶（trxB）及杆菌硫醇合成相关基因。综上，本研究支持体内存在多条平行通路共同介导二硫吡咯烷酮类前药还原活化的模型。

关键词

二硫吡咯烷酮；抗生素；硫柳素；全霉素；锌；硫氧还蛋白还原酶；杆菌硫醇

研究目的

明确枯草芽孢杆菌中激活含二硫键抗生素硫柳素的细胞还原通路，阐明杆菌硫醇、FAD依赖性二硫还原酶及相关调控因子在硫柳素前药活化中的作用，解析多通路平行活化的分子机制，为理解二硫吡咯烷酮类抗生素作用模式与细菌耐药性产生机制提供依据。

研究思路

以枯草芽孢杆菌为模式菌，采用正向遗传学与反向遗传学结合策略，构建杆菌硫醇合成、氧化还原酶、调控因子等相关基因缺失菌株，通过硫柳素敏感性生长实验评估各基因在硫柳素活化中的作用；利用全基因组重测序筛选硫柳素抗性突变株，定位关键突变基因；结合基因回补与诱导表达实验验证基因功能，最终构建硫柳素体内还原活化的通路模型。

研究亮点

1. 首次系统证实枯草芽孢杆菌中杆菌硫醇（BSH）、TrxB、AhpF共同介导硫柳素的还原活化，存在多条独立平行通路。

2. 揭示Spx转录因子通过调控杆菌硫醇合成与硫氧还系统影响硫柳素敏感性，其作用不依赖单一通路。

3. 阐明二硫吡咯烷酮类抗生素因多通路活化，难以通过单基因突变产生高抗性，为新型抗菌药物开发提供靶点思路。

4. 为利用硫柳素特异性干扰胞内锌稳态、研究细菌锌缺乏适应机制提供工具与理论支撑。

可延伸的方向

1. 探究其他革兰氏阳性/阴性菌中硫柳素活化通路的保守性与差异性。

2. 解析杆菌硫醇、TrxB、AhpF还原硫柳素的生化机制与催化效率。

3. 基于多通路活化特点，设计联合用药方案以降低耐药性产生。

4. 拓展二硫吡咯烷酮类化合物作为金属稳态干扰剂在抗菌与抗肿瘤中的应用。

5. 深入研究Spx调控网络与氧化还原应激、金属稳态的交叉调控机制。

测量的数据及研究意义

1. 野生型与ΔbshC、Δbdr、ΔbrxAΔbrxB、ΔbrxAΔbrxBΔbdr菌株在0–2.5 μg/mL硫柳素中的生长曲线（图2），数据显示ΔbshC对硫柳素抗性显著提升，证明杆菌硫醇参与硫柳素体内活化；而Bdr、BrxA/BrxB缺失不提升抗性，说明其不参与主要活化通路。

2. 野生型、Δspx及回补菌株在硫柳素中的生长曲线（图4），数据显示Δspx抗性升高，Spx过表达则致敏，证明Spx通过激活下游还原通路增强硫柳素活化。

3. trxA、trxB诱导表达菌株的硫柳素生长表型（图5），数据显示TrxB过表达致敏、TrxA过表达轻微抗性，证明TrxB是关键还原酶，TrxA可能起竞争性抑制作用。

4. ΔahpC、ΔahpF菌株的硫柳素生长曲线（图6），数据显示ΔahpF抗性提升，证明AhpF参与硫柳素活化。

5. 6株抗性突变株全基因组重测序突变位点（表1），定位到spx无义突变、ahpF错义突变、trxA突变，直接关联氧化还原基因与硫柳素抗性。

6. 各突变株组合的生长表型，显示多通路突变可叠加提升抗性，支持平行活化模型。

结论

1. 枯草芽孢杆菌内硫柳素的还原活化由多条平行通路共同完成，核心因子包括杆菌硫醇（BSH）、FAD依赖性二硫还原酶TrxB与AhpF。

2. 杆菌硫醇直接参与硫柳素还原，是重要活化因子，但非唯一途径。

3. Spx转录因子通过激活trxA/trxB及杆菌硫醇合成基因正向调控硫柳素活化，其缺失会降低药物活化效率并产生抗性。

4. TrxB是关键活化还原酶，TrxA可能通过竞争性抑制或氧化灭活硫柳素降低活化效率；AhpF作为TrxB同源酶，也参与部分活化作用。

5. 二硫吡咯烷酮类抗生素因多通路平行活化，细菌难以通过单基因突变获得高抗性，具备良好的抗菌应用潜力。

使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义

使用芬兰Bioscreen Pro自动化生长分析仪在37℃振荡培养条件下，以15分钟为间隔连续监测OD600，获取至少三次生物学重复的细菌生长曲线，能够精准、高通量、定量比较不同菌株在不同浓度硫柳素作用下的生长滞后期、生长速率与最终生物量。该数据可直观反映菌株对硫柳素的敏感性差异，微小的抗性或致敏变化均可被稳定检测，为判断基因是否参与硫柳素活化提供可靠、可重复的表型证据，是体内功能验证的核心数据支撑，确保结论的准确性与统计学可靠性。