A glycine at position 105 leads to clavulanic acid and avibactam resistance in class A β-lactamases
105位甘氨酸导致A类β-内酰胺酶对克拉维酸和阿维巴坦产生耐药性
来源：The Journal of Biological Chemistry 2025, Volume 301, Issue 7, 110347
《生物化学杂志》，2025年，第301卷，第7期，文章编号110347
摘要
本研究针对A类β-内酰胺酶Ambler 105位“看门”残基展开饱和突变与深度测序 fitness 分析，覆盖BlaC、CTX-M-14、KPC-2、NmcA、TEM-1五种酶。结果显示，105位突变为甘氨酸（Gly）或精氨酸（Arg）可显著降低对克拉维酸与阿维巴坦的敏感性。BlaC I105R突变可提升羧苄西林活性并逃逸抑制剂作用；CTX-M-14与TEM-1的Y105G突变显著降低对阿维巴坦的敏感度，源于活性位点构象柔性增加。该位点是临床耐药突变热点，可为新型β-内酰胺酶抑制剂设计提供依据。
关键词
A类β-内酰胺酶；105位看门残基；克拉维酸；阿维巴坦；耐药性；饱和突变；深度测序；构象柔性
研究目的
揭示A类β-内酰胺酶105位氨基酸突变对克拉维酸、阿维巴坦等抑制剂耐药的影响，阐明分子机制，定位耐药突变热点，指导新型抑制剂研发。
研究思路
选取5种代表性A类β-内酰胺酶，对105位进行饱和突变建库；在抗生素/抑制剂压力下通过深度测序计算fitness值；测定突变株MIC、酶动力学、抑制常数与蛋白稳定性；解析晶体结构与NMR化学位移扰动，揭示结构与耐药机制。
研究亮点
1 首次跨5种A类酶系统证明105位Gly/Arg突变可导致对克拉维酸+阿维巴坦双重耐药。
2 发现TEM-1、CTX-M-14的Y105G是临床潜在的阿维巴坦耐药新突变。
3 阐明BlaC I105R通过扩大活性入口、降低抑制剂亲和力产生耐药。
4 证实Y105G可提升TEM-1稳定性，补偿催化效率下降，增强体内优势。
5 提出105位为可预测的临床耐药突变热点，指导新药设计。
可延伸的方向
1 监测临床菌株中105位Gly/Arg突变的流行率。
2 设计不依赖105位稳定结合的新一代β-内酰胺酶抑制剂。
3 探究105位突变对其他新抑制剂的交叉耐药谱。
4 联用抑制剂克服105位突变介导的耐药。
5 解析更多105位突变体的晶体结构，优化抑制剂分子对接。
测量的数据及研究意义
1 五种β-内酰胺酶的MIC数据（表1），明确野生型对底物与抑制剂的敏感性。
2 105位饱和突变库深度测序fitness数据（图3），筛选出Gly、Arg为耐药优势突变。
3 突变体MIC数据（表2），证实I105R、Y105G显著提升克拉维酸/阿维巴坦MIC。
4 steady-state 酶动力学参数（表3），揭示突变对底物催化效率的影响。
5 抑制曲线与Ki模拟数据（图4、表4），证明突变降低抑制剂结合亲和力。
6 蛋白熔解温度Tm数据（图6），显示Y105G增强TEM-1稳定性。
7 BlaC I105R晶体结构数据（图7），显示活性位点入口扩大、构象柔性上升。
8 NMR化学位移扰动数据（图7I），定位突变影响的局部区域。
结论
1 A类β-内酰胺酶105位突变为Gly或Arg可直接导致对克拉维酸和阿维巴坦耐药。
2 BlaC I105R通过扩大活性入口、降低抑制剂结合亲和力产生耐药。
3 CTX-M-14与TEM-1的Y105G通过增加活性位点构象柔性降低抑制效率。
4 Y105G可提高TEM-1热稳定性，补偿催化下降，形成体内选择优势。
5 105位是重要的临床耐药突变热点，现有抑制剂需针对性优化设计。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen C Pro全自动生长分析仪在37℃连续振荡培养，每15分钟自动监测OD600，精准测定不同抗生素/抑制剂浓度下大肠杆菌的生长状态；以OD无上升为判定标准，准确定义MIC值，为饱和突变库的筛选、耐药阈值判定提供高通量、标准化、无人工误差的定量数据，是深度测序fitness分析与耐药突变鉴定的核心实验依据。