Design, development, and validation of new fluorescent strains for studying oral streptococci
用于研究口腔链球菌的新型荧光菌株的设计、构建与验证
来源：Microbiology Spectrum 2025, Volume 13, Issue 8, e00168-25
《微生物学谱》，2025年，第13卷，第8期，文章编号e00168-25
摘要
本研究构建并验证了可稳定表达蓝色荧光蛋白mTagBFP2、绿色荧光蛋白sfGFP、红色荧光蛋白mScarlet-I3的戈登链球菌、变异链球菌、血链球菌菌株。将含组成型启动子Pveg、荧光基因与壮观霉素抗性基因aad9的片段整合至染色体转录沉默位点，不影响菌株适应性。除血链球菌sfGFP外，所有菌株均可产生特异性荧光信号，可用于生物膜内细菌与胞外聚合物的可视化与定量。三菌种共培养生物膜成像与单细胞分析显示，添加水或人唾液会增加所有菌株细胞膜完整性损伤，且损伤比例具有物种特异性。该荧光菌株为口腔微生物生态研究提供重要工具。
关键词
口腔链球菌；荧光菌株；mTagBFP2；sfGFP；mScarlet-I3；生物膜；共聚焦显微镜；单细胞分析
研究目的
构建稳定、高亮度、无适应性代价的蓝、绿、红三色荧光口腔链球菌菌株，验证其在多菌种生物膜成像、胞外基质定量与单细胞水平分析中的应用价值。
研究思路
筛选染色体无转录活性、不影响适应性的整合位点；构建Pveg驱动的mTagBFP2、sfGFP、mScarlet-I3表达盒；整合至戈登链球菌、变异链球菌、血链球菌；验证荧光特异性、亮度、成熟时间与菌株适应性；应用于双/三菌种生物膜成像、胞外基质标记与唾液诱导细胞死亡的单细胞定量。
研究亮点
1 首次在三种口腔链球菌中实现mTagBFP2与mScarlet-I3的稳定染色体表达，荧光强、光谱特异性好。
2 整合位点选择科学，不影响生长、生物膜形成与种间竞争适应性。
3 实现四通道同步成像：三种细菌荧光+eDNA/葡聚糖/SYTOX死菌染色。
4 完成单细胞水平定量分析，揭示唾液对不同链球菌的特异性杀伤差异。
可延伸的方向
1 构建更多颜色荧光菌株（如青色、黄色、远红）实现更高维度菌群标记。
2 将荧光基因与启动子融合，用于监测体内基因表达动态。
3 应用于体内口腔定殖、种间互作与药物筛选的实时成像。
4 优化血链球菌sfGFP表达，实现三色完全可用。
5 拓展至其他口腔致病菌与有益菌的荧光工具构建。
测量的数据及研究意义
1 生长曲线OD600数据（图1B、图2B-D），证明荧光整合不影响生长表型，仅戈登链球菌mTagBFP2晚期略有差异。
2 竞争指数与CFU数据（图1C、1D），证实插入位点不改变单菌种与混合培养适应性。
3 生物膜结晶紫定量数据（图2E-H），显示荧光菌株生物膜量与野生型无显著差异。
4 荧光强度动态数据（图3A-C），确定各蛋白成熟时间与通道特异性，变异链球菌与戈登链球菌信号优异。
5 宽场与超高分辨率共聚焦成像数据（图3D-F、图4、图5），实现多菌种、多组分清晰区分与定量。
6 SYTOX染色单细胞死亡定量数据（图6），揭示水与唾液对三种链球菌的物种特异性杀伤。
结论
1 成功构建三色染色体整合型荧光口腔链球菌，表达稳定、无适应性代价、荧光特异性强。
2 mTagBFP2与mScarlet-I3在三种菌中均有效，sfGFP在血链球菌中表达较弱。
3 该工具可实现多菌种生物膜空间结构、胞外基质与单细胞状态的精准定量。
4 人唾液可显著诱导血链球菌与变异链球菌死亡，对戈登链球菌影响较小，存在物种特异性。
5 该菌株体系为口腔微生物组原位、动态、单细胞机制研究提供标准化工具。
使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
使用Bioscreen C MBR全自动浊度分析仪连续18小时每小时监测OD600，获得高精度生长动力学曲线；严格对比野生型、插入位点突变株与荧光菌株的生长速率、延滞期、稳定期生物量，客观验证染色体整合不影响菌株生长适应性，排除荧光表达对生理的干扰，为菌株有效性提供核心定量证据。