全自动生长曲线分析仪

Synthesis and Evaluation of Aquatic Antimicrobial Peptides Derived from Marine Metagenomes Using a High-Throughput Screening Approach

利用高通量筛选方法合成与评估从海洋宏基因组提取的水生抗菌肽

来源：Marine Drugs, 2025, 23: 178

《海洋药物》，2025年，第23卷，文章编号178

摘要

本研究针对水产养殖中细菌性疾病频发与抗生素耐药问题，采用机器学习模型从凡纳滨对虾养殖池塘宏基因组中预测抗菌肽，传统土塘每兆碱基抗菌肽含量高于生物絮塘与高位池。共预测1033条潜在抗菌肽，经结构与理化性质筛选得到10条候选肽，通过无细胞蛋白表达系统高通量筛选出9条具有抗菌活性的肽，最终化学合成3条（K-5、K-58、K-61）。这3条肽对哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌均有抑制作用，其中K-5对溶藻弧菌MIC为25 μM，低浓度下细胞存活率高于70%，K-5与K-58在200 μM时溶血率低于5%。该研究证明机器学习与无细胞合成联用可高效挖掘海洋抗菌肽，为水产抗菌剂开发提供新方法。

关键词

机器学习；无细胞蛋白表达；海洋抗菌肽；宏基因组；水产致病菌；高通量筛选

研究目的

1 从对虾养殖池塘宏基因组中高效挖掘新型、安全、高效的水生抗菌肽。

2 建立机器学习联合无细胞表达的高通量抗菌肽筛选体系。

3 验证候选抗菌肽对水产主要致病菌的抑制活性、细胞毒性与溶血安全性。

4 为水产养殖提供无耐药性风险的新型抗菌候选分子。

研究思路

1 采集三种养殖模式池塘水样，提取宏基因组并测序。

2 利用Macrel、PepNet、dbAMP2.0机器学习模型逐级预测并筛选抗菌肽。

3 分析候选肽理化性质与结构，选取10条进行无细胞快速表达。

4 高通量检测抗菌活性，确定3条优势肽进行化学合成。

5 测定MIC、MBC、细胞毒性、溶血活性，电镜观察杀菌机制。

研究亮点

1 首次将多模型机器学习与无细胞蛋白表达联用，实现海洋宏基因组抗菌肽高通量快速挖掘。

2 从复杂环境样本中直接获得新型抗菌肽，无需分离培养微生物，突破资源限制。

3 筛选得到的K-5抗菌活性强、溶血性低、安全性好，具备水产应用潜力。

4 建立36小时内完成“预测-合成-活性检测”的高效筛选流程。

5 揭示不同养殖模式宏基因组中抗菌肽丰度差异，为生态抗菌资源开发提供依据。

可延伸的方向

1 优化K-5氨基酸序列，提升抗菌活性与稳定性。

2 开展抗菌肽在对虾、鱼类等养殖动物中的体内药效与安全性实验。

3 开发抗菌肽纳米制剂，提高水溶性、持效性与稳定性。

4 拓展筛选至其他海洋环境宏基因组，挖掘广谱抗菌肽。

5 研究抗菌肽与膜作用的分子机制，解析杀菌通路。

6 构建抗菌肽工程菌株，实现低成本规模化生产。

测量的数据及研究意义

1 宏基因组抗菌肽预测数据：不同池塘样本的抗菌肽数量与密度，来自图1、图2，意义为揭示土塘宏基因组含更丰富抗菌肽资源。

2 候选肽理化性质数据：电荷、等电点、疏水性、脂肪族指数，来自表1、表2，意义为筛选符合抗菌肽特征的候选分子。

3 无细胞表达产物抗菌活性数据：24小时细菌OD600生长曲线，来自图3，意义为快速鉴定9条具有抑菌活性的肽。

4 MIC与MBC数据：三种合成肽对四种致病菌的最低抑菌与杀菌浓度，来自图4，意义为定量评价抗菌效力，K-5对溶藻弧菌活性最优。

5 细胞毒性数据：HEK293T细胞存活率，来自图5A，意义为证实低浓度下无明显细胞毒性。

6 溶血活性数据：兔红细胞溶血率，来自图5B，意义为证明K-5、K-58溶血风险极低。

7 电镜形态数据：K-5处理后细菌表面结构变化，来自图6，意义为证实抗菌肽通过破坏细胞膜发挥杀菌作用。

结论

1 机器学习联合无细胞表达系统可高效、快速从海洋宏基因组中挖掘功能性抗菌肽。

2 传统土塘宏基因组的抗菌肽丰度显著高于生物絮塘和高位池。

3 筛选得到的K-5、K-58、K-61对四种水产致病菌均具有抑制活性。

4 K-5抗菌活性最强且安全性高，可作为水产抗菌候选药物进一步开发。

5 该研究为解决水产养殖抗生素耐药与食品安全问题提供新型绿色解决方案。

使用芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1 采用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在100孔板中高通量、连续24小时监测细菌OD600值，实现无细胞表达产物抗菌活性的快速、精准定量。

2 实时捕捉细菌生长抑制曲线，可在早期判断抑菌效果，大幅缩短筛选周期。

3 高精度、平行重复检测保证结果可靠性，为快速淘汰无活性肽、锁定候选肽提供关键数据支撑。

4 无需纯化无细胞表达产物，直接检测混合体系抗菌活性，简化流程、降低成本。

5 标准化、自动化的生长测定方法，使不同样本、不同肽之间的抑菌效果可直接比较，提升高通量筛选效率与准确性。