Characterization of Selenium Accumulation in Lactiplantibacillus plantarum Strains: A Biotechnological Approach
植物乳杆菌菌株中硒积累的特性分析：一种生物技术方法
来源：Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2025; 95(5): 44231
1.摘要
本研究旨在分析硒补充对两株益生菌植物乳杆菌DSM24730和299v的生长能力、胃肠道耐受性及硒结合能力的影响，明确微量元素硒对益生菌生理活性的调控作用及其作为硒载体的应用潜力。研究将两株菌培养在添加0–100 mg/L亚硒酸钠的MRS培养基中，实时监测生物量产生、生长动力学等关键生理参数，并通过模拟胃肠液实验评估菌株的存活能力。结果表明，中等硒浓度（5–10 mg/L）可促进两株菌的生长，而高浓度（50–100 mg/L）则抑制生物量产生并延迟生长启动，其中DSM24730对高硒更为敏感。植物乳杆菌299v在5 mg/L硒浓度下培养24 h后生物量达到0.23 g/L，表现出更快的生长速度、更高的生物量产量和更快速的硒吸收能力；而DSM24730在长时间培养后能积累更高水平的硒，72 h时299v和DSM24730的硒积累量分别达到0.45 mg Se⁴⁺/g和0.29 mg Se⁴⁺/g。模拟胃肠液耐受性实验显示，两株菌在酸性胃液中均能存活，但在硒浓度≥10 mg/L的肠液中存活率显著下降，呈现明显的剂量依赖性抑制效应。本研究证实299v更适合快速硒同化和生物量形成，而DSM24730更适合长时间高容量硒负载，强调了菌株选择和硒剂量优化对开发安全有效的富硒益生菌产品的重要性。
2.关键词（中文）
植物乳杆菌、硒补充、细菌生长动力学、生物积累、硒耐受性
3.研究目的
系统评估不同浓度亚硒酸钠对两株商业化益生菌植物乳杆菌DSM24730和299v生长动力学、生物量产生的影响；测定两株菌在模拟人体胃肠道环境中的存活能力，明确硒浓度对益生菌胃肠道耐受性的作用；定量分析两株菌对无机硒的生物积累能力和时间动力学特征；比较两株菌在硒代谢和耐受方面的菌株特异性差异，为开发高效、安全的富硒益生菌功能食品和膳食补充剂提供科学依据和技术支撑。
4.研究思路
首先制备实验培养基：以MRS培养基为基础，添加不同浓度的亚硒酸钠（0、5、10、20、50、100 mg Se⁴⁺/L），调节pH至5.0并灭菌备用。
其次进行菌株培养和生长监测：将处于对数生长期末期的两株植物乳杆菌以1%（v/v）的接种量接种到上述培养基中，34℃培养72 h；利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪实时监测0–34 h的光密度（OD）变化，绘制生长曲线并计算生长动力学参数；分别在24、48、72 h取样，通过离心、干燥测定生物量干重。
然后进行胃肠道耐受性评估：将培养24 h的富硒菌株分别重悬于添加不同硒浓度的模拟胃液和肠液中，37℃分别孵育3 h和5 h，采用滴板计数法测定活菌数变化。
接着进行硒含量测定：采用Variamine Blue分光光度法测定培养上清液中剩余的亚硒酸盐含量，通过初始浓度与剩余浓度的差值计算菌株的硒积累量，换算为每克干重生物量的硒结合量。
最后进行统计分析：采用多因素方差分析（ANOVA）和Tukey’s HSD检验对实验数据进行统计学处理，比较不同硒浓度和不同菌株间的差异显著性（p<0.05）。
5.研究亮点
首次系统比较了两株具有明确益生功能的植物乳杆菌（299v和DSM24730）的硒积累特性，揭示了显著的菌株特异性差异，为不同应用场景的菌株选择提供了精准依据。
同时评估了硒对菌株生长、生物量产生、胃肠道耐受性和硒积累能力的综合影响，不仅关注硒的生物转化效率，还考虑了益生菌的核心功能特性，研究结果更具实际应用价值。
明确了硒的剂量效应关系，确定了促进两株菌生长的最佳硒浓度范围（5–10 mg/L），并发现硒浓度≥10 mg/L会显著降低菌株在肠液中的存活率，为富硒益生菌产品的安全剂量设定提供了关键数据。
揭示了两株菌不同的硒积累动力学特征：299v具有快速硒吸收能力，适合短期发酵生产；DSM24730具有更高的最终硒积累量，适合长时间高容量硒负载，拓展了富硒益生菌的应用场景。
6.可延伸的方向
研究不同形态硒（如硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、硒纳米颗粒）对两株菌生长、耐受性和硒积累能力的影响，比较有机硒和无机硒的生物转化效率。
优化发酵工艺参数，包括初始pH、培养温度、接种量、碳氮源组成和硒添加时间，进一步提高菌株的硒积累效率和生物量产量。
分析菌株中硒的化学形态分布，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）技术鉴定硒代氨基酸、硒纳米颗粒等主要硒化合物，明确其生物转化途径。
开展动物实验，评估富硒益生菌在小鼠体内的硒生物利用度、组织分布和抗氧化、免疫调节等生理功效，验证其在改善硒缺乏方面的作用。
进行人体临床试验，研究富硒益生菌在健康人群和硒缺乏人群中的安全性、耐受性和有效性，确定适宜的摄入量和食用周期。
开发富硒益生菌发酵食品，如酸奶、奶酪、泡菜、发酵饮料等，优化产品配方和发酵工艺，提高产品中有机硒的含量和稳定性。
探索富硒益生菌在重金属解毒、肠道菌群调节、炎症性肠病辅助治疗等方面的潜在应用，拓展其功能属性。
7.测量的数据及其研究意义
生物量干重数据：来自图1A（植物乳杆菌DSM24730在不同硒浓度下0–72 h的生物量变化）和图1B（植物乳杆菌299v在不同硒浓度下0–72 h的生物量变化）。研究意义：直观展示了硒浓度对两株菌生物量产生的影响，证实中等硒浓度（5–10 mg/L）可促进生长，高浓度（50–100 mg/L）则抑制生长；确定了两株菌的最佳硒添加浓度，299v为5 mg/L，DSM24730为10 mg/L，为发酵培养基的优化提供了依据。
生长曲线和动力学参数数据：来自图2A（不同硒浓度下DSM24730的OD随时间变化曲线）、图2B（不同硒浓度下299v的OD随时间变化曲线）和表1（两株菌在不同硒浓度下的生长动力学参数）。研究意义：定量分析了硒对菌株延迟期、对数期、最大比生长速率和代时的影响，揭示了两株菌对硒的敏感性差异，DSM24730对高硒更敏感，延迟期从8 h延长至12 h，对数期从12 h缩短至2 h；为理解硒对细菌生长的调控机制提供了数据支持。
模拟胃肠道耐受性数据：来自表2（两株菌在不同硒浓度的模拟胃液和肠液中的活菌数）。研究意义：首次证实硒浓度对益生菌胃肠道存活率的剂量依赖性影响，发现硒浓度≥10 mg/L时，菌株在肠液中的存活率显著下降，尤其是299v；为富硒益生菌产品的安全剂量设定提供了关键依据，避免因硒过量导致益生菌失活。
硒生物积累数据：来自图3A（DSM24730在不同硒浓度下0–72 h的硒结合量）和图3B（299v在不同硒浓度下0–72 h的硒结合量）。研究意义：比较了两株菌的硒积累动力学特征，发现299v具有快速硒吸收能力，而DSM24730在长时间培养后能积累更高水平的硒；明确了两株菌作为硒载体的不同优势，为不同应用场景的菌株选择提供了指导。
8.结论
本研究全面评估了亚硒酸钠对两株益生菌植物乳杆菌DSM24730和299v生长动力学、硒积累能力和胃肠道耐受性的影响，得出以下主要结论：
硒对两株菌的生长具有剂量依赖性效应，中等浓度（5–10 mg/L）可促进生长，高浓度（50–100 mg/L）则抑制生长，其中DSM24730对高硒更为敏感。
两株菌表现出显著的菌株特异性差异：299v具有更快的生长速度、更高的生物量产量和更快速的硒吸收能力，在5 mg/L硒浓度下培养24 h生物量达到0.23 g/L，72 h硒积累量达到0.45 mg Se⁴⁺/g；DSM24730生长较慢，但在长时间培养后能积累更高水平的硒，且对高硒的耐受性相对较好。
模拟胃肠液实验表明，两株菌在酸性胃液中均能良好存活，但在硒浓度≥10 mg/L的肠液中存活率显著下降，呈现明显的剂量依赖性抑制效应，提示富硒益生菌产品的硒添加量应控制在10 mg/L以下。
299v更适合快速硒同化和短期发酵生产，可用于开发即食型富硒益生菌产品；DSM24730更适合高容量硒负载和长时间发酵，可用于开发需要持续释放硒的功能性食品。
菌株选择和硒剂量优化是开发安全有效的富硒益生菌产品的关键因素，本研究为富硒益生菌的工业化生产和应用提供了重要的理论依据和技术支撑。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了两株植物乳杆菌在不同硒浓度下的生长动力学，其研究意义主要体现在以下几个方面：
高通量自动化实时监测，保证数据的准确性和重复性：仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时监测最多96个样品的生长情况，每30分钟自动读取一次420–580 nm波长范围内的光密度值，连续监测34小时。这种高通量自动化的监测方式，避免了人工取样带来的操作误差和污染风险，保证了实验条件的均一性和数据的连续性。本研究中一次性完成了两株菌在6个硒浓度下的生长曲线测定，每个浓度设置3个生物学重复，总计36个样品的平行检测，实验效率较传统人工方法提升了数十倍，且数据重复性好，为后续统计分析提供了可靠的基础数据。
精准定量生长动力学参数，揭示硒对菌株生长的调控机制：通过Bioscreen测定的OD变化曲线，可以精确计算出延迟期（Δt_lag）、对数期（Δt_log）、初始OD、最大OD、最大比生长速率（μ_max）和代时（G）等关键生长动力学参数。本研究中发现，随着硒浓度的升高，DSM24730的延迟期从8 h延长至12 h，对数期从12 h缩短至2 h，最大比生长速率先升高后降低；而299v的延迟期仅从6 h延长至8 h，对数期从10 h缩短至2 h。这些定量参数清晰地揭示了硒对细菌生长周期各阶段的影响，表明高硒浓度主要通过延长延迟期、缩短对数期来抑制菌株生长，为理解硒的毒性机制提供了直接证据。
直观比较菌株对硒的敏感性差异，筛选优良富硒菌株：生长曲线可以直观地展示不同菌株在相同硒浓度下的生长响应差异。本研究中通过比较图2A和图2B可以明显看出，299v对硒的耐受性显著优于DSM24730，在10 mg/L和20 mg/L硒浓度下，299v的OD值明显高于DSM24730，且在50 mg/L和100 mg/L高硒浓度下仍能保持一定的生长能力。这种直观的比较方式，为快速筛选具有高硒耐受性的益生菌菌株提供了高效的技术手段。
为发酵工艺优化提供科学依据，提高富硒益生菌的生产效率：生长曲线反映了菌株在特定培养条件下的生长特性，为发酵工艺参数的优化提供了重要依据。例如，根据延迟期的长短可以确定最佳的接种时间和接种量，确保菌株在最短的时间内进入对数生长期；根据对数期的持续时间和最大比生长速率可以确定最佳的发酵周期，提高生产效率。本研究中，根据生长曲线数据确定两株菌的最佳接种时间为对数生长期末期（24 h），发酵周期为24–72 h，这为富硒益生菌的工业化发酵生产提供了科学指导。
为硒代谢和解毒机制研究提供基础数据：生长动力学的变化是菌株对环境胁迫的整体生理响应，反映了硒对菌株代谢过程的影响。本研究中发现，低浓度硒可以提高菌株的最大比生长速率，这可能是因为硒作为必需微量元素参与了谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的合成，增强了菌株的抗氧化能力；而高浓度硒则抑制生长，可能是因为过量的硒产生了氧化应激，破坏了细胞的正常代谢。这些生长动力学数据为进一步研究硒在细菌体内的代谢途径和解毒机制提供了重要的线索。
保证发酵过程的可重复性和稳定性，为工业化生产奠定基础：在工业化生产中，发酵过程的可重复性和稳定性至关重要。Bioscreen测定的生长曲线可以作为菌株质量控制的标准，确保每批次用于发酵的菌株都处于相同的生长阶段和活力水平。这有助于减少批次间的差异，保证产品质量的一致性，为富硒益生菌的工业化放大生产提供了可靠的技术保障。