Infant-Type Bifidobacteria as Biocontrol Agents: Suppressing Listeria monocytogenes via Key Virulence Gene Alteration
婴儿型双歧杆菌作为生物防治剂：通过关键毒力基因改造抑制单核细胞增生李斯特菌
来源：Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology Volume 2025, Article ID 6638044, 24 pages
1.摘要
婴儿型双歧杆菌作为靶向生物防治剂对抗单核细胞增生李斯特菌感染具有潜在价值，但菌株特异性抗菌效果和分子机制尚不明确。本研究通过全面的体外抗氧化和抗菌活性实验，系统评估了5株双歧杆菌的益生菌潜力，并采用RNA-seq转录组学技术，分析了与3株筛选出的婴儿型双歧杆菌共培养时单核细胞增生李斯特菌的全局转录组响应。结果表明，所有受试双歧杆菌菌株均具有显著的体外抗氧化和抗菌活性，其中3株婴儿型双歧杆菌对单核细胞增生李斯特菌的生长抑制作用尤为突出。与这些菌株共培养显著降低了李斯特菌的存活率，并调控了其关键基因的表达。大量差异表达基因富集在阴离子结合、ABC转运体、群体感应、肽聚糖生物合成和谷胱甘肽代谢等通路，提示婴儿型双歧杆菌存在共同的抗菌作用机制。研究进一步鉴定出ahpC、clpC、clpX、recN、arlR、rpoD、tlyA和hlyIII为3株菌共同作用的核心毒力相关差异表达基因，同时发现msrB、amiE、clpE和clpL等菌株特异性差异表达基因，反映了不同菌株在毒力抑制和应激响应机制上的差异。这些发现深化了对益生菌-病原体相互作用的理解，为开发靶向抗李斯特菌感染的生物防治策略奠定了基础。
2.关键词（中文）
抗菌、双歧杆菌、单核细胞增生李斯特菌、RNA测序、毒力基因表达
3.研究目的
系统评估5株不同来源双歧杆菌（包括3株婴儿型人源双歧杆菌和2株非人源双歧杆菌）的体外抗氧化活性和对单核细胞增生李斯特菌的抗菌活性，筛选出具有优异生物防治潜力的菌株；通过RNA-seq转录组学技术，全面解析单核细胞增生李斯特菌与3株婴儿型双歧杆菌共培养时的基因表达变化，揭示益生菌抑制病原菌的分子机制；比较不同婴儿型双歧杆菌菌株对李斯特菌转录组的影响，明确其共同和特异性的拮抗靶点及通路；为开发基于婴儿型双歧杆菌的安全、高效的生物防治剂，用于控制食品中李斯特菌污染和预防李斯特菌病提供科学依据和理论支撑。
4.研究思路
首先进行菌株培养与无细胞上清液制备：将单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002和5株双歧杆菌分别在适宜的培养基和培养条件下活化、传代，收集双歧杆菌培养物，通过离心和过滤除菌制备无细胞上清液（CFS），-80℃保存备用。
其次开展体外抗氧化活性测定：采用四种经典方法评估5株双歧杆菌CFS的抗氧化能力，包括DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧阴离子含量测定法和ABTS总抗氧化能力法，每个实验设置3个生物学重复。
然后进行体外抗菌活性测定：通过琼脂扩散法测定不同菌株CFS对李斯特菌的抑菌圈直径，初步评估抗菌活性；利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，测定不同浓度（5%、10%、20%、40%、60%、80%、100% v/v）CFS作用下李斯特菌的生长曲线，每1小时测定一次OD600值，连续监测27小时，定量分析抗菌活性的剂量依赖性和时间动力学特征。
接着进行共培养实验：将处于对数生长期的李斯特菌和3株筛选出的婴儿型双歧杆菌分别调整至10⁹ CFU/mL，按照10:1、1:1、1:10（v/v）的比例混合，在MRS和TSB等体积混合培养基中37℃厌氧共培养6小时；采用李斯特菌显色培养基平板计数法，测定不同共培养条件下李斯特菌的活菌数变化。
之后进行转录组学分析：收集1:1比例共培养和单独培养的李斯特菌菌体，提取总RNA，经质量检测合格后构建cDNA文库，使用Illumina NovaSeq X Plus平台进行测序；对原始测序数据进行质控和比对，计算基因表达水平，以|log₂FC|>1且p<0.05为标准筛选差异表达基因；进行GO功能分类和富集分析、KEGG通路分类和富集分析，以及基于VFDB数据库的毒力因子基因分类分析。
最后进行实时荧光定量PCR验证：选择clpC、hly和clpL三个代表性差异表达基因，设计特异性引物，以16S rRNA为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法进行定量分析，验证RNA-seq数据的可靠性。
5.研究亮点
首次系统比较了婴儿型人源双歧杆菌（HRB）和非人源双歧杆菌（non-HRB）对单核细胞增生李斯特菌的拮抗作用，明确了婴儿型HRB菌株在抗氧化和抗菌活性方面的优势，为益生菌菌株的筛选提供了新的方向。
采用高通量RNA-seq技术，全面解析了单核细胞增生李斯特菌对3株婴儿型双歧杆菌的全局转录组响应，鉴定出8个共同的核心毒力靶基因和多个菌株特异性靶基因，从分子水平揭示了益生菌抑制病原菌的作用机制。
发现婴儿型双歧杆菌主要通过干扰李斯特菌的ABC转运体、群体感应、肽聚糖生物合成和谷胱甘肽代谢等关键生物学过程，抑制其生长、应激存活和毒力表达，为开发新型抗菌药物提供了多个潜在靶点。
定量分析了共培养比例对李斯特菌存活率的影响，确定了当双歧杆菌与李斯特菌比例为1:10时抑制效果最为显著，为益生菌在食品工业和临床中的实际应用提供了重要的剂量参考。
结合体外活性实验和转录组学分析，建立了“表型-分子机制”的研究体系，使研究结果更具系统性和说服力，为后续益生菌-病原体相互作用的研究提供了方法学参考。
6.可延伸的方向
分离鉴定婴儿型双歧杆菌无细胞上清液中具有抗菌活性的具体代谢产物，如有机酸、细菌素、短链脂肪酸、胞外多糖等，明确其化学结构和作用靶点。
研究婴儿型双歧杆菌对单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的抑制作用，以及对已成熟生物膜的清除效果，评估其在食品加工设备表面消毒中的应用潜力。
开展动物体内实验，评估口服婴儿型双歧杆菌对小鼠李斯特菌感染的预防和治疗效果，检测小鼠组织器官中的细菌载量、炎症因子水平和肠道菌群变化，验证其生物安全性和有效性。
优化婴儿型双歧杆菌的培养条件，包括培养基组成、pH、温度、溶氧量和培养时间等，提高其抗菌代谢产物的产量，降低工业化生产成本。
开发多菌株复合益生菌制剂，利用不同菌株的协同抗菌作用，增强对李斯特菌的抑制效果，并拓展其抗菌谱。
研究婴儿型双歧杆菌与其他天然抗菌剂（如植物精油、溶菌酶、乳铁蛋白）的联合应用，探索协同抗菌的可能性，减少单一抗菌剂的使用剂量。
利用基因工程技术对婴儿型双歧杆菌进行改造，增强其特定抗菌代谢产物的表达或靶向递送能力，提高生物防治的效率和特异性。
开展临床试验，评估富含有益生菌的食品在健康人群和高危人群中预防李斯特菌感染的效果，为制定相关食品安全标准和膳食指南提供依据。
7.测量的数据及其研究意义
体外抗氧化活性数据：来自图1(a)（DPPH自由基清除率）、图1(b)（羟基自由基清除率）、图1(c)（超氧阴离子含量）和图1(d)（总抗氧化能力）。研究意义：全面评估了5株双歧杆菌的抗氧化能力，证实所有菌株均具有一定的抗氧化活性，但不同菌株的作用机制存在差异；发现婴儿型HRB菌株的DPPH自由基清除率显著高于non-HRB菌株，为筛选具有抗氧化功能的益生菌提供了实验依据。
体外抗菌活性数据：来自图2（琼脂扩散法抑菌圈直径）和图3（不同浓度CFS作用下李斯特菌的生长曲线）。研究意义：证实了双歧杆菌CFS对单核细胞增生李斯特菌具有显著的剂量依赖性抑制作用；B. breve的抑菌圈直径最大，且能将李斯特菌的对数生长期延迟至约15小时，显著优于其他菌株；筛选出B. breve、B. bifidum和B. longum subsp. infantis 3株抗菌活性最强的婴儿型双歧杆菌，为后续的共培养和转录组学研究奠定了基础。
共培养对李斯特菌存活率的影响数据：来自表2（不同共培养比例下李斯特菌的活菌数）。研究意义：明确了共培养比例与李斯特菌存活率的负相关关系，当双歧杆菌与李斯特菌的比例为1:10时，抑制效果最为显著；B. longum subsp. infantis在1:10比例下对李斯特菌的抑制作用最强，活菌数降至5.59 log CFU/mL；证实了活的双歧杆菌细胞对李斯特菌具有更强的抑制作用，为益生菌的实际应用提供了重要的剂量参考。
转录组学基础数据：来自图4(a)（基因表达韦恩图）、图4(b)（基因表达聚类热图）、图5（差异表达基因火山图）和图6（差异表达基因韦恩图）。研究意义：揭示了李斯特菌对不同婴儿型双歧杆菌的转录组响应特征，共鉴定出1040-1357个差异表达基因；发现超过50%的差异表达基因为3株菌共有，提示存在共同的抑制机制；同时也存在大量菌株特异性差异表达基因，反映了不同菌株抗菌机制的多样性。
功能富集分析数据：来自图7（GO功能分类图）、图8（GO富集分析图）、图9（KEGG通路分类图）和图10（KEGG富集分析图）。研究意义：通过GO和KEGG富集分析，明确了阴离子结合、ABC转运体、群体感应、肽聚糖生物合成和谷胱甘肽代谢等关键通路在婴儿型双歧杆菌抑制李斯特菌过程中的核心作用；发现B. bifidum和B. longum subsp. infantis对李斯特菌代谢过程的干扰能力更强，而B. breve则主要通过调控物质结合和转运相关基因发挥作用。
毒力因子基因分析数据：来自图11（毒力因子基因分类图）和图12（毒力因子基因表达倍数变化图）。研究意义：系统分析了差异表达基因在14个毒力因子类别中的分布情况；鉴定出ahpC、clpC、clpX、recN、arlR、rpoD、tlyA和hlyIII为3株双歧杆菌共同作用的核心毒力基因，同时发现msrB、amiE、clpE和clpL等菌株特异性靶基因；为开发靶向李斯特菌毒力的新型抗菌药物提供了多个潜在靶点。
qPCR验证数据：来自图13（代表性差异表达基因的qPCR验证结果）。研究意义：验证了RNA-seq数据的可靠性，确保了转录组分析结果的准确性；证实了clpC、hly和clpL基因在婴儿型双歧杆菌抑制李斯特菌过程中的关键作用，为进一步的功能验证实验奠定了基础。
8.结论
本研究系统评估了5株双歧杆菌的体外抗氧化和抗菌活性，并深入解析了3株婴儿型双歧杆菌抑制单核细胞增生李斯特菌的分子机制，得出以下主要结论：
5株受试双歧杆菌均具有显著的体外抗氧化和抗菌活性，其中3株婴儿型HRB菌株（B. breve、B. bifidum和B. longum subsp. infantis）的效果优于2株non-HRB菌株，表明婴儿型双歧杆菌在生物防治李斯特菌感染方面具有更大的潜力。
婴儿型双歧杆菌与李斯特菌共培养可显著降低其存活率，且抑制效果与共培养比例呈正相关，当双歧杆菌与李斯特菌的比例为1:10时，抑制效果最为显著，活菌数可降低3个数量级以上。
转录组学分析表明，婴儿型双歧杆菌通过调控李斯特菌的多个关键生物学过程发挥抑制作用，共同的作用靶点包括阴离子结合、ABC转运体、群体感应、肽聚糖生物合成和谷胱甘肽代谢等通路。
鉴定出ahpC、clpC、clpX、recN、arlR、rpoD、tlyA和hlyIII为3株双歧杆菌共同作用的核心毒力基因，这些基因主要参与李斯特菌的应激存活、毒力调控和细胞侵袭过程；同时存在msrB、amiE、clpE和clpL等菌株特异性靶基因，反映了不同菌株在抗菌机制上的差异。
本研究结果为开发基于婴儿型双歧杆菌的靶向生物防治剂提供了重要的理论依据和分子基础，有望在食品安全和公共卫生领域发挥重要作用。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了不同浓度5株双歧杆菌无细胞上清液（CFS）作用下单核细胞增生李斯特菌的生长曲线（图3），其研究意义主要体现在以下几个方面：
高通量自动化实时监测，提升实验效率与数据质量：Bioscreen C采用100孔蜂窝板设计，可同时对多达96个样品进行平行监测，每1小时自动读取一次600 nm波长下的光密度值，连续监测27小时。本研究中一次性完成了5株双歧杆菌在7个不同CFS浓度下的生长曲线测定，每个浓度设置3个生物学重复，总计105个样品的平行检测。这种高通量自动化的监测方式，不仅大幅提高了实验效率，还避免了人工取样过程中可能引入的操作误差和污染风险，保证了实验条件的均一性和数据的连续性、重复性，为后续的统计分析和结果解读提供了可靠的基础数据。
定量解析抗菌活性的剂量依赖性与时间动力学特征：通过Bioscreen C测定的生长曲线，可以直观且定量地分析不同浓度CFS对李斯特菌生长的影响，包括延迟期延长、对数期生长速率降低、最大生物量减少以及平台期提前等多个方面。研究发现，即使在低浓度（5% v/v）下，双歧杆菌CFS仍能显著延迟李斯特菌进入对数生长期，其中B. breve的效果最为突出，将李斯特菌的延迟期从对照组的5小时延长至约15小时；随着CFS浓度的增加，抑制效果逐渐增强，100%浓度的CFS几乎完全抑制了李斯特菌的生长。这种定量分析为客观比较不同菌株的抗菌活性强弱提供了标准化的方法，避免了琼脂扩散法只能反映终点抑菌效果的局限性。
快速筛选具有强抗菌活性的益生菌菌株：生长曲线能够全面反映抗菌剂对细菌整个生长周期的影响，是筛选高效抗菌菌株的重要工具。通过比较5株双歧杆菌CFS对李斯特菌生长曲线的影响，可以快速识别出抗菌活性最强的菌株。本研究中，根据生长曲线数据筛选出B. breve、B. bifidum和B. longum subsp. infantis 3株婴儿型双歧杆菌用于后续的共培养和转录组学研究，这一筛选过程高效、准确，为后续深入研究奠定了坚实的基础。
为抗菌作用机制的研究提供重要线索：不同类型的抗菌剂会导致细菌生长曲线呈现出不同的变化特征，这些特征可以为推断抗菌作用机制提供重要线索。例如，主要作用于细菌细胞壁合成的抗菌剂通常会导致细菌在对数期快速裂解，表现为OD值迅速下降；而影响细菌代谢或蛋白质合成的抗菌剂则主要表现为延迟期延长和对数期生长速率降低。本研究中，双歧杆菌CFS主要表现为显著延长李斯特菌的延迟期，而对对数期的生长速率影响相对较小，提示其可能主要通过干扰细菌的初始代谢适应过程、破坏细胞膜完整性或消耗培养基中的关键营养物质来发挥抗菌作用，这为后续的代谢组学和蛋白质组学研究指明了方向。
为实际应用中的剂量优化提供科学依据：生长曲线数据可以帮助确定抗菌剂的最低有效浓度（MIC）和最佳使用剂量。本研究发现，当CFS浓度达到20%时，即可显著抑制李斯特菌的生长；而当浓度达到100%时，抑制效果接近完全。这一结果为在食品工业中使用益生菌及其代谢产物作为生物防腐剂提供了重要的剂量参考，有助于在保证抗菌效果的前提下，最大限度地降低生产成本，同时避免对食品的感官品质产生不良影响。
验证其他抗菌实验结果的可靠性：Bioscreen C测定的生长曲线结果与琼脂扩散法的抑菌圈结果基本一致，进一步证实了双歧杆菌CFS对单核细胞增生李斯特菌的抗菌活性。这种多方法交叉验证的方式，提高了实验结果的可信度和科学性，确保了研究结论的可靠性。
为抗菌剂的联合应用研究奠定基础：Bioscreen C的高通量特性使其非常适合用于抗菌剂联合应用的研究。未来可以利用该仪器，系统评估婴儿型双歧杆菌CFS与其他天然抗菌剂（如植物精油、溶菌酶）的联合抗菌效果，探索协同抗菌的可能性，为开发高效、广谱的复合生物防腐剂提供技术支持。