Screening of Lactic Acid Bacteria and RSM-Based Optimization for Enhancing γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulation in Orange Juice
乳酸细菌筛选及基于响应面法（RSM）优化促进橙汁中γ-氨基丁酸（GABA）积累
来源：Foods 2026, 15, 71
1.摘要
本研究针对天然橙汁中γ-氨基丁酸（GABA）含量低、难以满足人体生理需求的问题，旨在筛选高产GABA的乳酸菌菌株并优化橙汁发酵工艺，开发富含GABA的功能性发酵橙汁。首先从52株分离自发酵食品的乳酸菌中，通过Berthelot比色法初筛和高效液相色谱（HPLC）复筛，获得两株高产GABA且性能稳定的菌株：副干酪乳杆菌ZY（Lcb. paracasei ZY）和鼠李糖乳杆菌SN12（Lcb. rhamnosus SN12）。系统评估表明，两株菌具有良好的发酵性能、耐酸耐胆盐等益生特性，且能在橙汁中良好生长繁殖。随后通过单因素实验考察初始pH、发酵温度、可溶性固形物含量、接种比例、接种量和发酵时间对GABA产量的影响，再利用Plackett-Burman设计筛选出初始pH、发酵温度和可溶性固形物含量为关键影响因素，进一步通过Box-Behnken响应面法优化得到最优发酵条件。在优化条件下，发酵橙汁中GABA含量达到0.89 g/L，较未接种橙汁提高39.06%。本研究证实了响应面法在发酵工艺优化中的有效性，为工业化生产富含GABA的功能性发酵橙汁提供了优良菌株和科学的工艺参数。
2.关键词（中文）
γ-氨基丁酸（GABA）、橙汁、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、单因素实验、响应面法（RSM）、功能性饮料
3.研究目的
从发酵食品来源的乳酸菌中筛选具有高产GABA能力、优良益生特性和橙汁底物适应性的菌株；系统研究发酵工艺参数对橙汁中GABA积累的影响，建立高效的发酵工艺模型；通过响应面法优化关键工艺参数，最大化橙汁中GABA的产量；为开发具有改善睡眠、缓解焦虑等生理功能的发酵橙汁产品提供理论基础和技术支撑。
4.研究思路
首先开展高产GABA乳酸菌筛选：构建包含52株乳酸菌的筛选库，采用Berthelot比色法进行快速初筛，获得15株潜在高产菌株；再通过HPLC进行精确定量，最终确定副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12为目标菌株。
其次进行菌株性能评估：利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定菌株的生长动力学，评估其发酵性能；通过模拟胃酸、胆盐和胃肠液实验，评价菌株的益生特性；将菌株接种到橙汁中培养，测定活菌数变化，评估其底物适应性。
然后进行发酵工艺优化：通过单因素实验，分别考察初始pH、发酵温度、可溶性固形物含量、两株菌接种比例、接种量和发酵时间6个因素对GABA产量的影响，确定各因素的适宜水平范围；采用Plackett-Burman设计从6个因素中筛选出对GABA产量影响显著的3个因素；利用Box-Behnken设计进行三因素三水平响应面实验，建立回归模型，分析因素间的交互作用，确定最优发酵条件。
最后进行模型验证：在最优条件下进行三次平行实验，验证模型的准确性和可靠性；比较单因素优化、Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计对GABA含量的提升效果，评估响应面法的优越性。
5.研究亮点
筛选获得两株兼具高产GABA能力、优良益生特性和橙汁适应性的乳酸菌菌株，为功能性发酵食品开发提供了新的菌种资源。
首次采用双菌株混合发酵橙汁生产GABA，并通过响应面法系统优化了发酵工艺，实现了GABA含量39.06%的显著提升，效果优于单一菌株发酵。
明确了初始pH、发酵温度和可溶性固形物含量是影响橙汁中GABA积累的关键因素，揭示了各因素间的交互作用规律，建立了可靠的预测模型。
全面评估了菌株的发酵性能和益生特性，确保了其作为食品发酵剂的安全性和功能性，为工业化应用奠定了基础。
6.可延伸的方向
优化发酵培养基组成，添加谷氨酸钠（GAD酶底物）、吡哆醛-5-磷酸（GAD酶辅因子）等物质，进一步提高GABA的转化效率和产量。
研究发酵过程中橙汁的风味物质、色泽、抗氧化活性、有机酸含量等品质指标的变化，优化工艺参数以平衡产品的功能性和感官品质。
开展中试和工业化放大试验，验证优化工艺在大规模生产中的可行性，评估生产成本、生产周期和产品稳定性。
通过动物实验和人体临床试验，验证该发酵橙汁改善睡眠、缓解焦虑、调节血压等生理功效，明确其作用机制和适宜摄入量。
开发复合发酵剂，结合酵母菌、双歧杆菌等其他微生物，进一步丰富产品的风味和功能性，拓展产品的应用场景。
研究GABA在橙汁加工（如杀菌、浓缩）和储存过程中的稳定性，开发合适的包装材料和储存条件，延长产品的保质期。
探索该发酵工艺在其他果汁（如苹果汁、葡萄汁、荔枝汁）中的应用，开发系列富含GABA的功能性发酵果汁产品。
7.测量的数据及其研究意义
GABA初筛数据：来自图1A（Berthelot比色法测定52株乳酸菌的GABA产量）。研究意义：快速从大量菌株中筛选出具有GABA产生能力的菌株，缩小了复筛范围，提高了筛选效率，为后续研究奠定了基础。
GABA定量数据：来自图1B（GABA标准品和菌株发酵液的HPLC色谱图）和图1C（HPLC定量15株高产菌株的GABA含量）。研究意义：准确测定了菌株的GABA产量，验证了初筛结果，排除了比色法的假阳性干扰，最终确定了副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12为最优菌株。
菌株生长动力学数据：来自图2A（副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12的生长曲线）。研究意义：明确了两株菌的生长周期，包括延迟期、对数生长期和稳定期的时间节点，证实了其良好的发酵性能，为发酵时间和接种量的优化提供了依据。
菌株益生特性数据：来自图2B（两株菌在pH 3.0、0.3%胆盐、模拟胃液和模拟肠液中的存活率）。研究意义：验证了菌株的胃肠道耐受性，确保其能够在人体消化道内存活并发挥益生作用，符合益生菌的基本要求。
橙汁中菌株生长数据：来自图A1（两株菌在橙汁发酵过程中的活菌数变化）。研究意义：证实了两株菌能够在橙汁这种复杂底物中良好生长繁殖，48h内活菌数可达到8.5 Log CFU/mL以上，为橙汁发酵的可行性提供了直接证据。
单因素实验数据：来自图3A-F（初始pH、发酵温度、可溶性固形物含量、接种比例、接种量和发酵时间对GABA产量的影响）。研究意义：确定了每个因素对GABA产量的影响趋势和最优水平范围，为后续响应面实验的因素水平设置提供了科学依据。
Plackett-Burman设计数据：来自表1（Plackett-Burman设计的方差分析）和表A4（Plackett-Burman实验设计及结果）。研究意义：从6个因素中筛选出初始pH、发酵温度和可溶性固形物含量为影响GABA产量的显著因素，减少了后续实验的工作量，提高了优化效率。
Box-Behnken设计数据：来自表2（Box-Behnken设计的方差分析）、表A6（Box-Behnken实验设计及结果）和图4（响应面图和等高线图）。研究意义：建立了GABA产量与三个关键因素之间的二次回归模型，分析了因素间的交互作用，预测了最优发酵条件，为工艺优化提供了定量依据。
模型验证数据：来自图5（不同优化方法下的GABA含量及提升率）。研究意义：验证了响应面模型的准确性和可靠性，比较了不同优化方法的效果，证实了响应面法在发酵工艺优化中的优越性。
8.结论
本研究成功筛选出两株高产GABA的乳酸菌菌株副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12，两株菌具有良好的发酵性能、益生特性和橙汁底物适应性。通过单因素实验和响应面法优化，确定了橙汁发酵生产GABA的最优工艺条件：初始pH 5.5、发酵温度37℃、可溶性固形物含量12.0°Bx、两株菌接种比例1:1、接种量6 Log CFU/mL、发酵时间96h。在该条件下，发酵橙汁中GABA含量达到0.89 g/L，较未接种橙汁提高39.06%。研究结果表明，响应面法能够有效优化橙汁发酵工艺，显著提高GABA的积累量。本研究为开发富含GABA的功能性发酵橙汁提供了优良的菌株资源和科学的工艺参数，具有重要的工业应用价值和市场前景。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12的生长动力学，其研究意义主要体现在以下几个方面：
高通量自动化监测，保证数据的准确性和重复性：仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时监测最多96个样品的生长情况，每2小时自动读取一次600nm处的光密度值，连续监测72小时。这种自动化监测方式避免了人工取样带来的误差和污染风险，保证了实验条件的均一性和数据的连续性。本研究中两株菌的生长曲线均呈现典型的“S”型，重复性良好，为后续实验提供了可靠的基础数据。
全面评估菌株的发酵性能，筛选优良发酵剂：通过生长曲线可以定量计算菌株的延迟期时长、最大比生长速率和稳定期生物量等关键动力学参数。结果显示，副干酪乳杆菌ZY和鼠李糖乳杆菌SN12的延迟期均较短（约6小时），对数生长期生长迅速，分别在20小时和24小时进入稳定期，且72小时内无明显衰亡。这表明两株菌具有生长快、代谢旺盛、发酵周期短等优点，适合作为食品发酵剂使用。
为发酵工艺参数优化提供科学依据：生长曲线明确了菌株的生长周期和代谢活性变化规律，有助于合理设置发酵时间。例如，GABA主要在菌株的对数生长期后期和稳定期前期积累，因此将发酵时间设置为96小时，能够保证菌株有足够的时间合成GABA。同时，生长曲线也为接种量的优化提供了参考，选择6 Log CFU/mL的接种量可以使菌株快速进入对数生长期，缩短发酵周期，提高生产效率。
指导混合发酵的接种比例优化：通过比较两株菌的生长曲线，可以发现它们的生长速率和稳定期生物量相近，这为选择1:1的接种比例提供了依据。在混合发酵过程中，两株菌能够同步生长，协同利用底物，避免了某一株菌过度生长而抑制另一株菌的情况，有利于提高GABA的产量。
为底物适应性研究提供对照：Bioscreen测定的是菌株在MRS培养基中的基础生长特性，这为后续评估其在橙汁等复杂底物中的生长能力提供了对照。通过比较菌株在MRS培养基和橙汁中的生长曲线，可以分析橙汁中的营养成分、pH值、渗透压等因素对菌株生长的影响，为进一步优化橙汁发酵培养基提供指导。
验证菌株的生长稳定性：连续72小时的生长监测显示，两株菌的生长曲线稳定，批次间差异小，说明菌株的遗传特性和生长性能稳定。这对于工业化生产至关重要，能够保证发酵过程的一致性和产品质量的稳定性，降低生产风险。