Cold stress enhances cryotolerance in Lacticaseibacillus rhamnosus B6 via membrane lipid remodeling and differential protein expression
冷应激通过膜脂质重塑和差异蛋白表达增强鼠李糖乳杆菌B6的冷冻耐受性
来源：Current Research in Microbial Sciences 9 (2025) 100453
1.摘要
本研究针对乳酸菌在冷冻保存过程中细胞存活率低、影响工业应用的问题，以两株表型不同的鼠李糖乳杆菌B6和KF7为研究对象，探究冷应激预处理对其液氮冷冻耐受性的影响及分子机制。结果表明，4℃冷应激2小时可显著提高两株菌的冷冻存活率，其中B6的存活率从44%提升至53%，显著高于KF7（10%提升至30%）；扫描电镜观察显示冷应激后B6细胞完整性保持良好，而KF7的细胞破裂和塌陷明显减少。进一步研究发现，冷应激使B6细胞膜不饱和脂肪酸（UFA）含量显著增加，UFA与饱和脂肪酸（SFA）的比值从1.36升高至1.62，有效提高了膜流动性。蛋白质组学分析鉴定出325个差异表达蛋白，其中219个显著上调，主要参与脂肪酸生物合成、转录翻译、DNA修复和物质转运等过程。此外，透射电镜发现B6具有明显的荚膜结构，推测其可能在冷冻保护中发挥重要作用。本研究揭示了鼠李糖乳杆菌B6通过膜脂质动态重塑和协同蛋白表达调控的双重抗冻机制，为制备高细胞活力的益生菌制剂和直投式发酵剂提供了理论依据和工艺指导。
2.关键词（中文）
鼠李糖乳杆菌、冷应激、脂肪酸、冷冻耐受性、蛋白质组学
3.研究目的
明确冷应激预处理对鼠李糖乳杆菌冷冻存活率的影响，比较不同表型菌株（B6和KF7）的冷冻抗性差异；解析冷应激增强冷冻耐受性的分子机制，阐明膜脂质重塑和差异蛋白表达在其中的核心作用；探究菌株特异性细胞表面特征（如荚膜）与冷冻耐受性的关联；为工业生产中高活力益生菌和直投式发酵剂的菌株筛选、工艺优化提供理论基础和技术支撑。
4.研究思路
首先开展基础生长特性测定：利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪绘制B6和KF7的生长曲线，确定对数中期（OD600=0.8）作为冷应激处理的时间点。
其次进行冷冻耐受性表型验证：将两株菌分别在30℃（对照）和4℃（冷应激）处理2小时后液氮冷冻24小时，通过平板计数法计算存活率；采用PI/cFDA双染色流式细胞术从单细胞水平分析活死细胞比例；利用扫描电镜观察冷冻后细胞的形态和完整性。
然后解析膜脂质变化机制：提取冷应激前后B6的细胞膜总脂质，通过GC-MS分析脂肪酸组成和含量变化，计算UFA/SFA比值，明确膜脂质重塑对膜流动性的影响。
接着进行蛋白质组学分析：采用Label-free定量蛋白质组学技术，鉴定冷应激前后B6的差异表达蛋白；通过GOG/KOG数据库进行功能注释和通路富集分析，筛选关键抗冻蛋白和调控通路。
最后综合表型和组学结果：构建冷应激增强B6冷冻耐受性的分子机制模型，提出荚膜的潜在作用，并指出后续研究方向。
5.研究亮点
首次系统揭示了鼠李糖乳杆菌的双重抗冻机制：通过动态膜脂质重塑提高膜流动性，同时协同调控脂肪酸合成、转录翻译、DNA修复等多个通路的蛋白表达，共同抵御冷冻损伤。
发现菌株特异性荚膜结构对冷冻耐受性的关键贡献：B6特有的荚膜可有效减少冰晶对细胞的机械损伤，维持细胞完整性，为筛选高抗冻性乳酸菌提供了新的表型指标。
鉴定出多个关键抗冻靶点蛋白：如RecQ DNA解旋酶（上调11.73倍）、乙酰辅酶A羧化酶（上调3.4倍）、柠檬酸裂解酶酰基载体蛋白（上调2.66倍）等，为通过基因工程手段改良菌株抗冻性提供了明确靶点。
建立了从表型验证到多组学机制解析的完整研究体系，为其他乳酸菌、双歧杆菌等工业微生物的抗冻机制研究提供了可复制的方法学参考。
6.可延伸的方向
构建荚膜合成关键基因（如eps基因簇）的敲除和过表达突变体，通过冷冻存活率实验和电镜观察，直接验证荚膜在B6冷冻耐受性中的具体作用及分子机制。
优化冷应激工艺参数，包括预处理温度（2-10℃）、时间（0.5-4小时）、培养基成分（添加糖类、氨基酸等保护剂），建立工业化应用的最优冷应激预处理方案。
结合转录组学、代谢组学和蛋白质组学进行多组学联合分析，构建冷应激响应的全局调控网络，解析不同层面调控的协同作用。
对关键抗冻蛋白（如RecQ、ACCase）进行异源过表达，构建基因工程菌株，评估其冷冻存活率、生长性能和益生功能的变化，验证其工业应用潜力。
研究冷应激预处理对B6在冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥等其他常见微生物保存方式中的存活率影响，拓展其应用范围。
比较不同种属、不同来源乳酸菌的冷应激响应机制，筛选通用的抗冻靶点和调控策略，开发广谱性的乳酸菌抗冻保护技术。
开展中试和工业化生产试验，验证冷应激预处理在大规模发酵和冷冻保存中的实际效果，优化生产工艺参数，降低生产成本。
7.测量的数据及其研究意义
菌株生长动力学数据：来自图1（鼠李糖乳杆菌B6和KF7在37℃ MRS培养基中的生长曲线）。研究意义：明确两株菌具有高度相似的生长周期，均在0-2小时为延迟期，2-12小时为对数生长期，12小时后进入稳定期；确定OD600=0.8的对数中期作为冷应激处理的统一时间点，排除了生长阶段差异对后续实验结果的干扰，保证了实验材料的生理状态一致性。
冷冻存活率数据：来自图2（液氮冷冻后B6和KF7的存活率柱状图）。研究意义：定量证实4℃冷应激2小时可显著提高两株菌的冷冻存活率，且B6的基础抗冻性和冷应激响应能力均显著优于KF7；为后续选择B6作为机制研究对象提供了直接的表型依据。
流式细胞术活死细胞比例数据：来自图3（PI/cFDA双染色的流式细胞图，包括a-f六个子图）。研究意义：从单细胞水平验证了冷应激对细胞活力的保护作用，与平板计数结果高度一致；同时区分了活细胞、死细胞和损伤细胞的亚群，更全面地反映了冷冻对细胞的损伤程度，弥补了平板计数仅能检测可培养细胞的局限性。
细胞形态和超微结构数据：来自图4（液氮冷冻后B6和KF7的扫描电镜图，a-d四个子图）和图6（B6和KF7的透射电镜图，a-b两个子图）。研究意义：直观展示了冷冻对细胞形态的影响，B6细胞表面光滑完整，而KF7出现明显的细胞膜破裂和细胞质泄漏；透射电镜首次发现B6具有厚而致密的荚膜结构，而KF7无荚膜，为荚膜参与抗冻提供了关键的形态学证据。
细胞膜脂肪酸组成数据：来自表1（冷应激前后B6膜脂肪酸组成及含量变化）。研究意义：定量分析了冷应激对7种主要膜脂肪酸含量的影响，发现饱和脂肪酸（C14:0、C16:0）含量显著下降，不饱和脂肪酸（C16:1、C18:1）含量显著上升，UFA/SFA比值从1.36升高至1.62；直接证实了膜脂质重塑是B6适应冷应激、提高膜流动性的核心机制。
差异表达蛋白质组数据：来自图5（差异蛋白的GOG/KOG通路分类图）和表2（部分显著上调的差异蛋白列表）。研究意义：鉴定出325个差异表达蛋白，其中219个显著上调；明确了冷应激主要激活了脂肪酸生物合成、转录翻译、DNA修复、ABC转运和氨基酸代谢等通路；发现了多个高丰度上调的关键抗冻蛋白及其功能，为解析分子机制提供了全面的蛋白质组学证据。
8.结论
冷应激预处理可显著增强鼠李糖乳杆菌B6和KF7的液氮冷冻耐受性，其中B6表现出更优异的抗冻性能。冷应激通过诱导B6细胞膜发生动态脂质重塑，增加不饱和脂肪酸含量并提高UFA/SFA比值，有效维持了低温下细胞膜的流动性和完整性。同时，冷应激导致325个蛋白差异表达，219个显著上调，通过增强脂肪酸合成、维持转录翻译效率、促进DNA损伤修复和调节细胞渗透压等多种途径，共同保护细胞免受冷冻损伤。此外，B6特有的荚膜结构可能通过减少冰晶形成和机械损伤，进一步提高其冷冻存活率。本研究揭示了鼠李糖乳杆菌B6的双重抗冻机制，为工业生产中制备高活力益生菌制剂和直投式发酵剂提供了重要的理论基础和技术指导。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了鼠李糖乳杆菌B6和KF7的生长动力学，其研究意义主要体现在以下方面：
标准化生长周期测定，确保实验结果的可靠性：仪器采用全自动连续监测模式，每小时自动读取600nm处的光密度值，连续监测24小时，完整记录了菌株从延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长过程。结果显示两株菌的生长曲线高度重合，生长速率和稳定期生物量无显著差异，这一结果排除了基础生长性能差异对后续冷冻耐受性实验的干扰，确保了冷应激处理时两株菌处于完全相同的生理状态，是所有实验结果可信的前提。
高通量平行检测，提高实验效率和数据重复性：仪器的100孔蜂窝板设计可同时测定最多96个样品的生长曲线，本研究中同时设置了B6和KF7两个菌株，每个菌株3个生物学重复，实现了高通量平行检测。与传统的试管培养+手动分光光度计测定相比，大幅减少了人工操作带来的系统误差，数据的重复性和准确性显著提高。同时，仪器内置的高精度恒温控制系统（37℃±0.1℃）和每次读数前的自动侧向振荡功能，保证了所有孔内培养条件的均一性，进一步确保了不同样品生长曲线的可比性。
精准量化生长参数，为实验设计提供科学依据：通过生长曲线可以精确计算出菌株的延迟期时长、最大比生长速率、对数中期时间点和稳定期生物量等关键动力学参数。本研究中根据生长曲线确定OD600=0.8的对数中期作为冷应激处理的时间点，此时细胞代谢最活跃，对环境刺激的响应最敏感，能够最真实地反映冷应激诱导的分子变化。这一精准的时间点选择对于后续蛋白质组学和脂肪酸分析获得高质量数据至关重要。
验证菌株的工业生产适用性：工业发酵生产对菌株的生长速率和生物量有严格要求，生长过慢会延长发酵周期，增加生产成本；生物量过低则会降低最终产品的活菌数。本研究中B6和KF7均表现出良好的生长性能，12小时即可达到稳定期，且生物量较高，说明它们具有工业化生产的潜力。而B6在保持良好生长性能的同时还具有优异的冷冻耐受性，使其成为更理想的工业菌株候选。
为后续实验提供统一的取样标准：生长曲线不仅为冷应激处理提供了时间点，也为细菌收集、蛋白提取、脂肪酸分析等所有后续实验的取样时间提供了统一标准。例如，蛋白质组学分析需要在细胞处于对数中期时取样，以获得最能反映冷应激响应的蛋白表达谱；脂肪酸分析也需要在相同的生长阶段取样，以排除生长阶段对膜脂肪酸组成的影响。Bioscreen的生长曲线数据为这些实验的标准化操作提供了明确的指导。
为菌株改良提供表型评价基础：在后续的基因工程菌株构建中，生长曲线是评估突变体生长性能是否受到影响的重要指标。如果过表达某个抗冻蛋白导致菌株生长速率显著下降，即使其冷冻存活率提高，也可能不适合工业应用。因此，Bioscreen测定的生长曲线数据是综合评价基因工程菌株应用潜力的重要依据。