Development of a non-targeted metabolomics-based screening method for elucidating the metabolic characteristics and potential applications of Lacticaseibacillus paracasei
开发一种基于非靶向代谢组学的筛选方法，用于阐明副干酪乳杆菌的代谢特性及潜在应用
来源：Food Chemistry 466 (2025) 141943
1.摘要
本研究针对传统益生菌筛选过度依赖胃肠耐受性、易遗漏代谢功能优异菌株的问题，提出了一种基于非靶向代谢组学的副干酪乳杆菌功能菌株筛选新策略。首先系统评估了60株副干酪乳杆菌的生长特性、耐酸耐胆盐能力、模拟胃肠液耐受性和12种碳源利用能力，发现所有菌株均无法耐受模拟胃肠环境，但多数具有良好的生长性能和广泛的碳源利用谱。随后采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术，对56株可发酵乳的菌株进行发酵上清液和褐变发酵乳的非靶向代谢组学分析。结果表明，副干酪乳杆菌IMAU32642的发酵上清液中特异性产生二十二碳六烯酸（DHA）、亮氨酰苯丙氨酸、齐墩果醛、油酰胺和油酸等多种有益代谢物；副干酪乳杆菌IMAU60048在褐变发酵乳中显著高产花生四烯酸和辛酸，具有独特的产品开发潜力。该研究建立了一套高效的益生菌功能筛选技术体系，为功能性食品的开发提供了优质菌株资源和理论依据。
2.关键词（中文）
液相色谱-质谱联用、发酵上清液、褐变发酵乳
3.研究目的
突破传统益生菌筛选依赖胃肠耐受性的局限，建立一种基于代谢产物功能的副干酪乳杆菌高效筛选方法；系统评估60株副干酪乳杆菌的基础生物学特性，明确其生长、抗逆和碳源利用能力；全面分析菌株在发酵上清液和褐变发酵乳两种基质中的代谢产物组成，筛选出具有独特有益代谢特征的功能菌株；阐明不同发酵基质对菌株代谢组的影响，为副干酪乳杆菌在功能性乳制品中的多元化应用提供理论支撑和菌株资源。
4.研究思路
首先开展基础生物学特性评估：对60株副干酪乳杆菌进行生长曲线测定、pH2.0-3.0耐酸性实验、0.3%-0.5%胆盐耐受性实验、模拟胃肠液存活率测定，以及12种单一碳源利用能力分析，初步排除生长性能差、无法发酵乳的菌株。
其次进行非靶向代谢组学检测：分别制备56株可发酵乳菌株的发酵上清液和褐变发酵乳样品，采用UPLC-Q-TOF-MS在正负离子模式下进行代谢组学分析；通过Progenesis QI软件进行数据预处理，结合Metlin、ChemSpider和HMDB数据库进行代谢物鉴定，利用KEGG数据库进行代谢通路富集分析。
然后筛选功能菌株：对比不同菌株的代谢产物谱，鉴定具有潜在健康益处的差异代谢物；筛选出特异性高产有益代谢物的菌株，分析其在不同发酵基质中的代谢特征差异，明确其最适应用场景。
最后综合评估：结合基础生物学特性和代谢组学结果，筛选出最具开发价值的功能菌株，提出其在功能性食品中的应用方向。
5.研究亮点
提出了“不依赖活菌存活，直接基于代谢产物功能”的益生菌筛选新范式，解决了胃肠耐受性差但代谢功能优异菌株的应用难题，拓展了益生菌的应用边界。
首次完成了60株副干酪乳杆菌在发酵上清液和褐变发酵乳两种基质中的大规模代谢组学比较，系统揭示了发酵基质对菌株代谢产物谱的显著调控作用。
筛选出两株具有独特应用价值的功能菌株：IMAU32642是目前发现的少数能合成DHA的乳酸菌菌株，IMAU60048在褐变发酵乳中特异性高产花生四烯酸和辛酸，为高端功能性乳制品开发提供了全新的菌株资源。
建立了“基础特性初筛-非靶向代谢组学分析-功能菌株复筛-应用场景匹配”的完整技术体系，为双歧杆菌、乳球菌等其他益生菌的功能筛选提供了可复制的方法学参考。
6.可延伸的方向
对IMAU32642和IMAU60048进行微胶囊化包被技术研究，优化包埋材料和工艺，提高其胃肠耐受性，验证其作为活菌制剂的体内益生功效。
开展动物实验和人体临床试验，分别验证IMAU32642发酵上清液的改善认知、调节血脂功效，以及IMAU60048褐变发酵乳的抗菌、抗炎和免疫调节功效。
优化两株菌株的发酵工艺参数（温度、pH、接种量、碳氮源比例），通过响应面法提高DHA、花生四烯酸等目标代谢物的产量。
采用转录组学和代谢组学联合分析，解析IMAU32642合成DHA、IMAU60048合成花生四烯酸的分子机制，通过代谢工程手段强化其合成通路。
开发基于这两株菌株的系列功能性产品，如DHA强化发酵饮料、花生四烯酸儿童褐变乳、天然抗菌型食品保鲜剂等。
将该代谢组学筛选方法拓展应用于双歧杆菌、链球菌等其他益生菌和食品微生物的功能筛选，建立大规模微生物代谢产物数据库。
研究不同菌株复配对代谢产物谱的协同效应，开发具有多重健康功效的复合益生菌发酵产品。
7.测量的数据及其研究意义
菌株基础生长动力学数据：来自图1（60株副干酪乳杆菌在厌氧条件下的生长动力学曲线）。研究意义：完整呈现了不同菌株的生长周期特征，明确了多数菌株在24小时进入稳定期；筛选出IMAU80853（延迟期长达10小时）和IMAU11991（最终生物量极低）等不适合工业生产的菌株，为后续实验的菌株选择提供了基础依据。
菌株耐酸性数据：来自图2（10株副干酪乳杆菌在pH2.0、2.5、3.0条件下的生长曲线）和图S1A。研究意义：定量证实所有菌株在pH≤2.5条件下完全无法生长，仅少数菌株在pH3.0下有微弱生长，明确了其胃酸耐受性缺陷，为后续转向代谢产物导向的筛选策略提供了直接依据。
菌株耐胆盐数据：来自图3（60株副干酪乳杆菌在0.3%胆盐浓度下的生长曲线）和图S1B。研究意义：发现0.3%胆盐会显著延长菌株延迟期并降低生物量，0.5%胆盐则完全抑制所有菌株生长；结合模拟胃肠液实验结果，彻底排除了这些菌株作为口服活菌制剂的应用可能。
菌株碳源利用能力数据：来自图4（60株副干酪乳杆菌对12种碳源的利用情况热图）。研究意义：系统绘制了菌株的碳源利用谱，发现所有菌株均可利用果糖、半乳糖和甘露糖，仅17株可利用全部12种碳源；同时筛选出14株无法利用乳糖的菌株，排除了其在普通发酵乳生产中的应用潜力。
代谢组学总离子流数据：来自图5A-B（IMAU60048发酵上清液在正负离子模式下的总离子色谱图）和图S3-S4。研究意义：验证了UPLC-Q-TOF-MS分析方法的稳定性、分离度和重复性，为后续代谢物的准确定性和定量分析提供了可靠的基础数据。
共有代谢物及通路数据：来自图5C（发酵上清液共有代谢物热图）、图5D（褐变发酵乳共有代谢物热图）和图5E（共有代谢物KEGG通路分析）。研究意义：鉴定出33种具有潜在健康益处的共有代谢物，富集到不饱和脂肪酸生物合成、精氨酸生物合成等7条核心代谢通路，揭示了副干酪乳杆菌代谢产物的共性功能特征。
褐变发酵乳特有代谢物数据：来自图6A（褐变发酵乳特有代谢物分布热图）、图6C（特有代谢物KEGG通路分析）和表S1。研究意义：鉴定出42种褐变发酵乳特有代谢物，富集到泛酸和辅酶A生物合成、维生素B6代谢等15条代谢通路；发现IMAU60048的花生四烯酸和辛酸产量显著高于其他菌株，明确了其在褐变发酵乳开发中的独特优势。
模拟胃肠液存活率数据：来自原文3.3节的平板计数结果。研究意义：直接证实所有菌株在模拟胃液（pH2.5，3小时）和模拟肠液（pH8.0，4小时）中均无法存活，进一步凸显了开发无活菌代谢产物类产品的必要性和可行性。
8.结论
本研究系统评估了60株副干酪乳杆菌的基础生物学特性，发现所有菌株均无法耐受模拟胃肠环境，但具有良好的生长性能和广泛的碳源利用能力。建立了基于非靶向代谢组学的功能菌株筛选新方法，成功突破了传统益生菌筛选的局限，筛选出两株具有独特应用价值的功能菌株：副干酪乳杆菌IMAU32642的发酵上清液中特异性产生DHA、亮氨酰苯丙氨酸等多种有益代谢物，可作为功能性成分的生产菌株；副干酪乳杆菌IMAU60048在褐变发酵乳中高产花生四烯酸和辛酸，具有开发高端功能性褐变乳制品的巨大潜力。该研究为副干酪乳杆菌的多元化应用提供了新思路和优质菌株资源，同时也为其他益生菌的功能筛选提供了可借鉴的技术体系。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了60株副干酪乳杆菌在正常MRS培养基、不同pH条件和不同胆盐浓度下的生长曲线，其研究意义主要体现在以下方面：
高通量平行检测，实现大规模菌株快速初筛：仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定96个样品的生长曲线。本研究中一次性完成了60株菌株在3种pH梯度、2种胆盐浓度下的生长动力学测定，每个条件设置3个生物学重复，总计完成了近千个样品的平行检测。与传统的试管培养+手动分光光度计测定相比，实验效率提升了数十倍，在短时间内完成了大规模菌株的基础特性评估，为后续代谢组学实验缩小了菌株范围。
动态连续监测，精准捕捉菌株生长表型差异：仪器每30分钟自动读取一次600nm处的光密度值，连续监测48小时，完整记录了菌株从延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长周期。例如图1中清晰地显示了IMAU80853在10小时才进入对数生长期，而IMAU11991虽然早期生长迅速但最终生物量极低，这些动态表型差异是传统终点计数法无法准确捕捉的。通过定量计算生长速率、最大生物量和延迟期时长等参数，为工业生产菌株的初步筛选提供了精准的量化标准。
标准化培养环境，保证实验结果的可靠性和可比性：仪器内置高精度恒温控制系统，可将培养温度稳定在37℃±0.1℃；配合矿物油覆盖和厌氧培养盒，创造了严格的厌氧环境；每次读数前进行自动侧向振荡，保证所有孔内菌液均匀一致。这种标准化的培养条件消除了温度波动、氧气分布不均、人工操作误差等干扰因素，确保了不同菌株、不同批次实验结果的高度可比性。例如在耐酸耐胆盐实验中，只有在完全一致的培养环境下，才能准确将生长差异归因于pH或胆盐的胁迫作用。
定量评估胁迫条件对菌株生长的抑制程度：通过生长曲线的定量分析，能够精确计算不同胁迫条件下菌株的生长抑制率、延迟期延长倍数和生物量下降幅度。例如图2显示pH3.0时IMAU10430的生长速率仅为正常条件下的12%，图3显示0.3%胆盐使IMAU80793的最大OD600降低了75%。这些定量数据为客观评价菌株的抗逆性提供了统一的标准，避免了主观判断的偏差，同时也为后续菌株的微胶囊化保护研究提供了明确的胁迫参数。
为后续实验提供关键的时间节点依据：Bioscreen测定的生长曲线明确了所有菌株在24小时左右进入稳定期，因此后续的发酵上清液制备、模拟胃肠液实验、碳源利用实验等均选择在培养24小时后进行，保证了实验材料的生理状态一致性和实验结果的可比性。同时，对数中期的时间点也为后续的代谢组学样品采集提供了准确的依据，确保能够捕捉到菌株代谢最活跃时期的产物谱。
验证菌株的工业生产适用性：工业发酵对菌株的生长速率和生物量有严格要求，生长过慢或生物量过低会显著增加生产成本、降低生产效率。本研究中通过生长曲线筛选出的生长快、生物量高的菌株，能够有效缩短发酵周期、提高设备利用率。而排除的IMAU80853和IMAU11991，若直接用于工业生产，会导致发酵效率低下、产品质量不稳定等问题，因此Bioscreen的生长曲线数据是菌株工业化应用评估的第一道关键关卡。
为菌株抗逆性机制研究提供基础：不同菌株在酸和胆盐胁迫下的生长表型差异，为后续研究其抗逆性分子机制提供了明确的研究对象。例如可以选择耐酸性相对较强的IMAU10430和耐酸性最弱的菌株进行比较转录组学分析，挖掘与酸耐受相关的关键基因和调控通路，为后续通过基因工程手段改良菌株抗逆性提供靶点。