Characteristics and in vitro properties of potential probiotic strain Fructobacillus tropaeoli KKP 3032 isolated from orange juice
从橙汁中分离出的潜在益生菌株Fructobacillus tropaeoli KKP 3032的特性及体外特性
来源：Folia Microbiologica (2025) 70:177–194
1.摘要
本研究聚焦于果糖乳酸菌（FLAB）中研究较少的Fructobacillus tropaeoli物种，以从橙汁中分离的菌株KKP 3032为对象，系统评估其生物学特性和体外益生菌潜力。通过16S rRNA测序和MALDI-TOF MS完成菌株鉴定，利用芬兰Bioscreen C Pro全自动生长曲线分析仪验证其果糖嗜性和高渗透压耐受性，同时检测其对胃肠道环境的适应性（低pH、胆盐）、表面特性（自聚集、疏水性）、抗菌活性及抗生素敏感性。结果表明，该菌株具有典型的果糖嗜性，能在30%果糖浓度下良好生长，40%果糖中仍可存活；对pH 3.0和1.5%胆盐具有显著耐受性，24小时自聚集率达58.84%，表面疏水性为65.69%；对单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌等6种食源性致病菌均表现出抗菌活性，其中对李斯特菌的抑制作用最强（抑菌圈26.3mm）；抗生素敏感性除卡那霉素外均符合EFSA标准。研究证实F. tropaeoli KKP 3032具有较高的益生菌潜力，可作为果糖型益生菌或高糖食品的保护性培养物进行开发。
2.关键词（中文）
果糖乳酸菌、果糖型益生菌、胆盐、自聚集、疏水性、抗菌活性
3.研究目的
填补Fructobacillus tropaeoli物种功能特性研究的空白，系统表征从橙汁分离的KKP 3032菌株的代谢特征、环境适应性和益生菌潜力；明确其果糖嗜性的分子基础和工业应用价值，评估其作为新型果糖型益生菌及高糖食品保护性培养物的可行性；为拓展FLAB在食品和制药领域的应用提供科学依据和菌株资源。
4.研究思路
首先通过16S rRNA基因扩增测序和MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱分析完成菌株的分子鉴定，并构建系统发育树明确其进化地位。
其次进行生化特性分析：使用API CHL 50试剂盒测定碳水化合物发酵谱，检测过氧化氢酶活性。
然后利用芬兰Bioscreen C Pro仪器开展生长动力学研究：分别在含果糖、葡萄糖及两者混合的培养基中，于有氧和厌氧条件下测定生长曲线，验证果糖嗜性；在1%-40%不同果糖浓度的培养基中测定生长曲线，评估渗透压耐受性；通过Gompertz模型拟合计算最大比生长速率（μmax）和吸光度变化（ΔA）等动力学参数。
接着系统评估益生菌潜力：模拟胃肠道环境测定低pH（1.5、2.0、3.0）和不同浓度胆盐（0.3%-1.5%）下的存活率；通过分光光度法测定自聚集能力和细胞表面疏水性；采用琼脂孔扩散法测定对6种食源性致病菌的抗菌活性。
最后通过E-test法检测8种常用抗生素的最低抑菌浓度（MIC），依据EFSA标准评估其安全性；综合所有实验结果，分析该菌株的应用潜力和存在的风险。
5.研究亮点
首次系统报道了从橙汁中分离的F. tropaeoli菌株的完整益生菌特性，填补了该物种在食品微生物领域的研究空白。
发现该菌株具有异常优异的高渗透压耐受性，能在40%果糖浓度下生长，这一特性在已报道的F. tropaeoli菌株中极为罕见，为其在高糖食品中的应用奠定了基础。
证实其对多种食源性致病菌具有广谱抗菌活性，尤其是对单核细胞增生李斯特菌表现出极强的抑制作用，具有作为天然生物防腐剂的潜力。
明确了其果糖嗜性的代谢机制：葡萄糖代谢依赖外部电子受体（氧气或果糖），这与FLAB缺失adhE基因的特征一致，为理解其生态适应性提供了理论支持。
抗生素安全性评估显示除卡那霉素外均符合EFSA标准，且卡那霉素抗性大概率为固有抗性，转移风险较低，为其作为益生菌的安全性提供了初步保障。
6.可延伸的方向
对菌株进行全基因组测序，精确定位卡那霉素抗性基因的位置，分析其是否位于可移动遗传元件上，明确抗性转移风险。
开展动物体内实验，验证菌株在小鼠胃肠道中的定植能力、对肠道菌群的调节作用及免疫增强效果，评估其体内益生功能。
分离纯化菌株产生的抗菌代谢产物，通过质谱和核磁共振解析其化学结构，明确抗菌作用机制，开发新型天然食品防腐剂。
优化菌株在高糖食品中的应用工艺，比如果汁、果酱、蜜饯等，研究其对产品感官品质、营养成分和货架期的影响。
探索菌株与其他益生菌（如双歧杆菌、乳杆菌）的协同作用，开发适合高糖食品的复合益生菌制剂。
研究菌株在果糖基发酵食品中的应用，比如果汁发酵、果酒酿造和果醋生产，评估其对发酵过程和产品品质的影响。
开展人群临床试验，验证其对果糖不耐受人群的改善作用，拓展其在功能性食品领域的应用。
7.测量的数据及其研究意义
菌株形态学数据：来自图1（600倍放大的F. tropaeoli KKP 3032显微图像）。研究意义：直观展示了该菌株典型的革兰氏阳性杆状形态，符合Fructobacillus属的形态特征，为初步鉴定提供了形态学依据。
16S rRNA基因扩增电泳数据：来自图2（16S rRNA基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图）。研究意义：验证了PCR扩增的特异性和成功率，获得了约1500bp的目标条带，为后续测序鉴定提供了可靠的模板。
系统发育分析数据：来自图3（基于16S rRNA基因序列的邻接系统发育树）。研究意义：明确了菌株的进化地位，显示其与F. tropaeoli模式菌株的16S rRNA基因相似性达99.85%，从分子水平确证了菌株的分类学身份。
MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱数据：来自图4（F. tropaeoli KKP 3032与参考菌株DSM 23246的质谱对比图）。研究意义：通过蛋白水平的指纹图谱对比，进一步验证了菌株的身份，发现两株菌共享7个特征峰，同时存在少量菌株特异性差异，补充了分子鉴定的结果。
碳水化合物发酵谱数据：来自表1（API 50 CHL试剂盒检测的发酵碳水化合物列表）。研究意义：显示该菌株仅能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇和葡萄糖酸钾4种碳水化合物，且果糖发酵最快，符合FLAB代谢谱窄的典型特征，为其代谢特性研究提供了基础数据。
不同碳源和氧条件下的生长动力学数据：来自表2（最大比生长速率μmax和吸光度变化ΔA）和图5（有氧/厌氧条件下不同碳源培养基中的生长曲线）。研究意义：定量证实了菌株的果糖嗜性，在果糖培养基中的生长速率显著高于葡萄糖培养基；明确了其葡萄糖代谢依赖外部电子受体，厌氧条件下葡萄糖培养基中生长严重受限；发现果糖与葡萄糖混合培养基中生长最佳，为优化其培养条件提供了依据。
有氧/厌氧平板生长对比数据：来自图6（GYP琼脂上有氧和厌氧条件下的生长情况）。研究意义：直观展示了该菌株在葡萄糖培养基中厌氧条件下几乎不生长，而明串珠菌不受影响，进一步验证了其果糖嗜性和对电子受体的需求。
不同果糖浓度下的生长动力学数据：来自表3（不同果糖浓度下的μmax和ΔA）和图7（1%-40%果糖浓度中的生长曲线）。研究意义：量化了菌株的渗透压耐受范围，证实其能在10%-40%果糖中生长，最适生长浓度为10%果糖；即使在40%高果糖浓度下仍有明显生长，证明其具有优异的高渗耐受性，为其在高糖食品中的应用提供了关键参数。
低pH耐受性数据：来自图8（不同pH条件下30分钟和120分钟的存活率）。研究意义：显示菌株在pH 3.0下120分钟存活率仍达95%以上，能耐受人体胃酸环境；pH 2.0下30分钟存活率为56%，但120分钟后无法存活；pH 1.5下完全失活，为评估其胃肠道存活能力提供了数据支持。
胆盐耐受性数据：来自图9（不同浓度胆盐下24小时和48小时的存活率）。研究意义：证明菌株对胆盐具有极强的耐受性，在0.3%-1.5%胆盐浓度下24小时存活率均超过95%，甚至在1.5%高浓度胆盐下48小时存活率仍达95.38%，表明其能在小肠环境中良好存活。
自聚集和表面疏水性数据：来自图10（4小时和24小时的自聚集率及表面疏水性）。研究意义：显示菌株24小时自聚集率达58.84%，表面疏水性为65.69%，均高于益生菌的最低标准（自聚集>40%，疏水性>40%），表明其具有良好的肠道黏膜定植潜力。
抗菌活性数据：来自表4（对6种食源性致病菌的抑菌圈直径）。研究意义：证实菌株对所有测试致病菌均有抑制作用，其中对单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈达26.3mm（极强抑制），对大肠杆菌和沙门氏菌也有很强的抑制作用，为其作为生物防腐剂提供了直接证据。
抗生素敏感性数据：来自表5（8种抗生素的MIC值及EFSA标准对比）。研究意义：显示菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素等7种抗生素的MIC均符合EFSA标准，仅对卡那霉素耐药；结合FLAB固有氨基糖苷类抗性的特点，初步判断其安全性良好，但需进一步验证抗性基因的转移风险。
8.结论
本研究系统表征了从橙汁中分离的Fructobacillus tropaeoli KKP 3032菌株的生物学特性和体外益生菌潜力，证实其是一株具有典型果糖嗜性的优良候选益生菌。该菌株具有以下核心优势：一是代谢特性独特，偏好果糖作为碳源，且具有异常优异的高渗透压耐受性，能在40%果糖浓度下生长；二是胃肠道适应性强，能耐受pH 3.0的胃酸和1.5%的胆盐，具备在人体消化道存活的能力；三是表面特性优良，自聚集和疏水性均达到益生菌标准，具有肠道定植潜力；四是抗菌活性广谱，对多种食源性致病菌尤其是单核细胞增生李斯特菌有显著抑制作用；五是安全性良好，除卡那霉素外抗生素敏感性均符合EFSA标准，且卡那霉素抗性大概率为固有抗性。
综合来看，F. tropaeoli KKP 3032具有作为新型果糖型益生菌和高糖食品保护性培养物的巨大潜力，可应用于果汁、果酱、蜜饯等果糖丰富的食品中，既能提升产品的营养价值，又能延长货架期。但仍需进一步开展全基因组测序和体内动物实验，以明确其抗性基因的转移风险和体内益生效果，为其商业化应用提供更全面的科学依据。
9.芬兰Bioscreen C Pro仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C Pro全自动生长曲线分析仪完成了两项核心实验：果糖嗜性验证和高糖耐受性评估，其产生的生长曲线数据具有以下关键研究意义：
高通量平行检测，提升实验效率和可比性：仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时进行多个菌株、多种培养基条件和多个生物学重复的平行测定。本研究中一次性完成了3种碳源培养基（FYP、GYP、GYP-F）×2种氧条件（有氧/厌氧）×5次生物学重复，以及5种果糖浓度（1%-40%）×5次生物学重复的生长测定，大幅减少了人工操作带来的系统误差和批次间差异，保证了不同实验组间数据的高度可比性。
动态连续监测，完整捕捉生长全过程：仪器每小时自动读取一次600nm处的光密度值，连续监测24小时，完整记录了菌株从延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长周期。与传统的定时手动取样和平板计数法相比，这种连续监测方式能够更准确地反映菌株的生长动力学特征，避免了终点法无法捕捉生长细节的缺陷。例如，通过生长曲线可以清晰观察到菌株在不同果糖浓度下延迟期的长短、对数生长期的斜率和最大生物量的差异，为定量分析生长参数提供了基础。
精确控制实验环境，保证数据可靠性：仪器内置高精度恒温控制系统和连续振荡功能，可将培养温度精确控制在30℃±0.1℃，并通过均匀振荡保证所有样品的通气条件一致。这种标准化的培养环境消除了温度波动、氧气分布不均等环境因素对微生物生长的影响，显著提高了实验的重复性和可靠性。本研究中所有生长曲线的生物学重复间变异系数均小于5%，证明了数据的稳定性。
定量分析生长参数，深入解析代谢特性：通过Gompertz模型对生长曲线进行拟合，可精确计算出最大比生长速率（μmax）、延迟期时间（D）和最大吸光度变化（ΔA）等关键动力学参数。这些定量参数比单纯的生长曲线更能准确反映菌株的代谢活性和环境适应性。例如，本研究通过μmax的对比，明确了菌株在果糖培养基中的生长速率是葡萄糖培养基的近2倍，在混合糖培养基中更是达到了葡萄糖培养基的3.5倍，从而定量证实了其果糖嗜性；通过ΔA的对比，发现10%果糖浓度下的生物量最高，确定了其最适生长糖浓度。
直接验证果糖嗜性，揭示代谢机制：通过对比有氧和厌氧条件下葡萄糖培养基中的生长曲线，发现厌氧条件下菌株几乎不生长，而有氧条件下生长良好，这一结果直接验证了FLAB葡萄糖代谢依赖外部电子受体的核心特征。结合分子生物学研究中关于adhE基因缺失的报道，从生理水平揭示了其果糖嗜性的代谢机制，为理解FLAB的生态适应性提供了关键证据。
为工业应用提供关键工艺参数：高糖耐受性实验的生长曲线数据明确了菌株的渗透压耐受范围和最适生长条件，证明其能在30%果糖浓度下保持良好的生长速率，40%果糖中仍可存活。这些数据为其在高糖食品中的应用提供了直接的工艺参数，例如在果汁发酵中可直接使用10%果糖浓度的培养基进行种子培养，在果酱生产中可添加该菌株作为保护性培养物而无需担心高糖环境抑制其生长。
标准化数据输出，便于国际交流与对比：Bioscreen C是全球微生物学领域公认的生长动力学标准检测仪器，其产生的数据具有良好的通用性和国际可比性。本研究获得的生长参数可直接与其他FLAB菌株的研究结果进行对比，为全球果糖乳酸菌资源的整合研究和应用开发提供了标准化的数据基础。