Antimicrobial Activity, Antibiotic Susceptibility, and Growth Kinetics of Lactic Acid Bacteria and Yeasts Isolated from Selected Ugandan Cheese Varieties
从部分乌干达奶酪品种分离出的乳酸细菌和酵母的抗菌活性、抗生素敏感性及生长动力学
来源：Preprints.org (www.preprints.org) | NOT PEER-REVIEWED | Posted: 12 December 2025 doi:10.20944/preprints202512.1194.v1
1.摘要
本研究针对乌干达传统奶酪缺乏标准化发酵剂、微生物群落复杂且存在安全隐患的问题，系统评估了从当地成熟奶酪中分离的乳酸菌（LAB）和酵母的抗菌活性、抗生素敏感性及pH依赖生长动力学，以筛选兼具技术适用性和安全性的潜在发酵剂菌株。通过形态学、生物化学及MALDI-TOF MS方法完成菌株鉴定，采用琼脂孔扩散法和纸片点样法测定菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性，依据EUCAST和CLSI标准通过纸片扩散法检测21种常用抗生素的敏感性，利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪监测菌株在pH 2.5-8.0范围内的生长动力学。结果显示，乌干达奶酪微生物群落具有高度多样性，其中戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌表现出显著抑制作用，而多数菌株对革兰氏阴性致病菌无明显拮抗效果；抗生素敏感性检测发现乳酸片球菌存在多重耐药性，部分机会致病菌（如鲍曼不动杆菌）也表现出高水平耐药性；生长动力学分析表明乳酸菌最适生长pH为4.5-5.5，解脂耶氏酵母和葡萄球菌则偏好近中性条件（pH 6.5-7.5）。综上，乌干达传统奶酪中存在具有技术价值的微生物菌株，但需严格进行抗生素耐药性筛查，戊糖片球菌和植物乳杆菌经基因组安全验证后可作为发酵剂开发的候选菌株。
2.关键词（中文）
乳酸菌、酵母菌、抗菌活性、抗生素耐药性、发酵剂、奶酪微生物群、乌干达
3.研究目的
填补乌干达传统奶酪微生物资源功能特性研究的空白，系统表征当地成熟奶酪中乳酸菌和酵母的抗菌活性、抗生素安全性及pH生长适应性，明确不同菌株的技术潜力和安全风险，筛选适合当地生产条件的安全、高效发酵剂或辅助发酵剂菌株，为乌干达奶酪产业的标准化、品质提升和食品安全控制提供科学依据和技术支撑。
4.研究思路
首先从乌干达西南部奶酪加工厂收集3个月成熟期的高达、帕尔马干酪、切达和杰克奶酪样品，从已建立的微生物库中选取经形态、生化和MALDI-TOF MS鉴定的5种乳酸菌（戊糖片球菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌）、1种酵母（解脂耶氏酵母）及1种表皮相关菌（马胃葡萄球菌）作为研究对象。
其次开展抗菌活性评价：采用琼脂孔扩散法制备菌株无细胞上清液，测定对3种食源性致病菌的抑菌圈直径；通过纸片点样法验证结果，以乳酸链球菌素为阳性对照，无菌培养基为阴性对照。
然后进行抗生素敏感性检测：使用21种涵盖8大类的抗生素纸片，按照Kirby-Bauer法进行实验，采用肠球菌属折点作为乳酸菌的判定标准，通过抑菌圈直径判定菌株的敏感、中介或耐药表型。
接着利用芬兰Bioscreen C仪器测定生长动力学：设置pH 2.5-8.0共9个梯度，30℃恒温振荡培养72小时，每15分钟记录一次OD₆₀₀值，采用LOESS法平滑生长曲线并截断至3600分钟以消除后期干扰。
最后综合抗菌活性、耐药性谱和pH生长特性，评估各菌株作为发酵剂的适用性，提出安全评估要求和产业应用建议。
5.研究亮点
首次系统开展乌干达传统奶酪微生物的功能特性研究，从抗菌、安全和生理三个维度全面评估菌株的发酵剂潜力，为当地乳制品产业提供了第一手基础数据。
发现戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌具有特异性抗菌活性，为开发天然食品生物保鲜剂提供了新的候选菌株，同时揭示了多数乳酸菌主要通过酸化和竞争排斥而非分泌抗菌物质发挥生态作用。
明确了奶酪微生物群落的pH生态位分化规律，定量验证了pH是驱动奶酪发酵过程中微生物演替的核心环境因子，为理解传统奶酪的微生物生态学提供了新证据。
首次报道了乌干达奶酪中存在多重耐药乳酸菌和机会致病菌，强调了传统乳制品生产中卫生控制和菌株基因组安全筛查的必要性，为食品安全风险防控提供了警示。
采用标准化的国际检测方法和高通量生长动力学分析技术，保证了研究结果的可靠性和国际可比性，为后续全球奶酪微生物资源的对比研究奠定了基础。
6.可延伸的方向
对筛选出的戊糖片球菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌进行全基因组测序，全面鉴定其是否携带可转移的耐药基因、毒力因子和代谢相关基因，完成符合国际标准的食品安全评估。
分离纯化戊糖片球菌产生的抗菌物质，解析其化学结构、作用机制和稳定性，优化发酵生产条件，开发针对革兰氏阳性菌的天然食品防腐剂。
开展实验室规模和中试规模的模拟奶酪发酵实验，评估候选菌株的产酸速率、蛋白水解能力、脂肪分解能力及对奶酪感官品质的影响，优化发酵工艺参数。
调查乌干达不同地区、不同季节、不同工艺奶酪的微生物群落多样性和耐药性分布，建立区域性奶酪微生物资源库和耐药性数据库。
研究奶酪中耐药基因的水平转移风险，评估传统乳制品在“同一健康”框架下抗菌药物耐药性传播中的作用，制定针对性的防控策略。
开发适合当地生产条件的复合发酵剂配方，结合传统工艺实现奶酪生产的标准化，同时保留传统产品的风味特征。
探究解脂耶氏酵母等酵母菌株在奶酪成熟过程中的功能，开发用于提升奶酪风味的辅助发酵剂。
7.测量的数据及其研究意义
抗菌活性定性数据：来自图1和图2。图1显示乳酸乳球菌、植物乳杆菌、解脂耶氏酵母等多数菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌均无明显抑菌圈；图2对比了琼脂孔扩散和纸片点样两种方法，证实戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌产生清晰的抑菌圈。研究意义：明确了不同菌株的抗菌谱差异，发现戊糖片球菌具有特异性抗革兰氏阳性菌活性，为其作为生物保鲜剂的开发提供了直接实验证据；同时验证了多数乳酸菌在奶酪中主要通过非分泌型机制发挥微生物拮抗作用。
抗生素敏感性数据：来自表1和表2。表1列出了21种用于检测的抗生素名称、缩写及浓度；表2展示了8株分离菌对各抗生素的敏感性表型（S=敏感、I=中介、R=耐药）及对应的抑菌圈直径。研究意义：全面揭示了乌干达奶酪微生物的耐药性现状，发现乳酸片球菌对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类和四环素类抗生素均存在耐药性，鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素高水平耐药，为发酵剂的安全筛选划定了红线；同时反映了当地乳制品生产环境中抗菌药物耐药性的传播风险，为加强生产卫生管理提供了依据。
pH依赖生长动力学数据：来自图3a和图3b。图3a为植物乳杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌在pH 2.5-8.0下的LOESS平滑OD₆₀₀生长曲线；图3b为戊糖片球菌、解脂耶氏酵母、马胃葡萄球菌、金黄色葡萄球菌在相同pH梯度下的生长曲线。研究意义：定量表征了不同菌株的pH适应范围和最适生长条件，明确了乳酸菌的嗜酸特性和酵母、葡萄球菌的嗜中性特性，揭示了奶酪发酵过程中微生物的时间生态位分化规律；为发酵剂的合理搭配提供了生理基础，例如嗜酸乳酸菌主导早期产酸，嗜中性微生物参与后期成熟；同时为优化奶酪发酵的pH调控工艺提供了数据支持。
8.结论
本研究系统表征了从乌干达成熟奶酪中分离的乳酸菌、酵母及相关微生物的功能特性，证实当地传统奶酪蕴含丰富且具有技术潜力的微生物资源。其中戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌具有特异性抗菌活性，植物乳杆菌和乳酸乳球菌表现出良好的酸性生长适应性，是开发发酵剂的优质候选菌株。
研究同时发现了不容忽视的安全风险：乳酸片球菌存在多重耐药性，奶酪中还检出了鲍曼不动杆菌等具有耐药性的机会致病菌，强调了传统乳制品生产中必须加强卫生控制，且所有拟用于发酵剂的菌株都需经过全基因组测序以排除可转移耐药基因。
生长动力学分析清晰揭示了pH作为关键环境因子驱动奶酪微生物群落演替的规律：乳酸菌在早期低pH条件下占主导地位，完成产酸和凝乳过程；而解脂耶氏酵母和葡萄球菌在后期pH升高的成熟阶段发挥作用，参与风味物质的形成。
综上，乌干达传统奶酪中的微生物资源具有重要的开发价值，但需在严格安全评估的基础上进行发酵剂开发，通过标准化生产工艺提升产品品质和安全性，推动当地奶酪产业的可持续发展。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了8株微生物在9个pH梯度下的72小时生长动力学，每15分钟自动记录一次OD₆₀₀值，获得了高时间分辨率的连续生长数据，其研究意义主要体现在以下方面：
高通量平行检测能力：仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时进行多个菌株、多个条件的平行实验。本研究中一次性完成了8株菌×9个pH梯度×3次生物学重复的生长测定，大幅提高了实验效率，减少了人工操作带来的系统误差和批次间差异，保证了不同菌株和不同pH条件下数据的可比性。
动态连续监测生长全过程：与传统的定时手动取样法相比，每15分钟一次的自动读数完整记录了微生物从延迟期、对数生长期、稳定期到衰亡期的整个生长周期。通过LOESS平滑处理后的生长曲线，能够准确计算各菌株的比生长速率、延迟期时长、最大OD₆₀₀值等关键动力学参数，更精准地反映了菌株在不同pH条件下的生理响应。
精确控制实验环境：仪器内置高精度恒温控制系统和连续振荡功能，保证所有样品在恒定的30℃温度和均匀的通气条件下培养，消除了温度波动和氧气分布不均对微生物生长的影响，显著提高了实验的重复性和可靠性。
定量解析pH生态位分化：通过对比不同pH下的生长曲线，定量确定了各菌株的最适生长pH、耐受pH范围和生长限制pH。例如发现戊糖片球菌可在pH 3.0下生长，是所有测试菌株中耐酸性最强的；而解脂耶氏酵母和葡萄球菌在pH 4.5以下几乎完全被抑制。这些定量数据清晰揭示了奶酪发酵过程中微生物的生态位分化规律，为理解传统奶酪的自然发酵机制提供了关键证据。
指导发酵剂的实际应用：生长动力学数据明确了不同菌株的生理特性和环境适应性，为发酵剂的选择和组合提供了科学依据。例如嗜酸的植物乳杆菌和乳酸乳球菌适合作为主发酵剂，在奶酪发酵早期快速产酸降低pH，抑制有害微生物生长；而嗜中性的解脂耶氏酵母适合作为辅助发酵剂，在奶酪成熟后期发挥蛋白水解和脂肪水解作用，提升产品风味。
标准化数据输出与国际可比性：Bioscreen C是全球微生物学领域公认的生长动力学标准检测仪器，其产生的数据具有良好的通用性和国际可比性。本研究获得的生长参数可直接与其他地区、其他类型奶酪的微生物研究结果进行对比，为全球奶酪微生物资源的整合研究和交流提供了标准化数据基础。