Revisiting the Synergistic In Vitro Antimicrobial and Antibiofilm Potential of Chlorhexidine Gluconate and Cetrimide in Combination as an Antiseptic and Disinfectant Agent
重新审视葡萄糖酸氯己定与西曲溴铵（三三胺）联合使用作为抗菌剂和消毒剂的体外协同抗菌及抗生物膜潜力
来源：Microbiol. Res. 2025, 16, 16
1.摘要
葡萄糖酸氯己定（CHG）和西曲溴铵（CTR）是广泛使用的防腐剂和消毒剂，但其联合协同作用的系统评估仍较为缺乏。本研究以环境分离株铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为模型，通过分数抑菌浓度指数（FICI）测定两者的协同抗菌活性，采用结晶紫染色法、刃天青实验结合明场及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估其对生物膜形成和预形成生物膜的作用。结果显示，CHG与CTR联合对铜绿假单胞菌生长具有显著协同抑制作用（FICI≤0.5）；在低于各自MIC的1/4浓度下，联合可显著降低金黄色葡萄球菌生物膜对聚苯乙烯表面的粘附能力，但对铜绿假单胞菌生物膜形成无明显影响。此外，该联合能显著降低两种细菌预形成生物膜内细胞的代谢活性和活力，展现出良好的生物膜根除潜力。进一步对含1.5% CHG和3.0% CTR的市售制剂进行广谱活性评估，证实其对ESKAPE病原体、结核分枝杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、致病性钩端螺旋体、念珠菌属、诺如病毒及腺病毒等多种临床相关微生物均具有高效杀灭效果。综上，CHG与CTR的经典联合仍是极具价值的生物杀灭剂，在感染防控的防腐和消毒领域仍具有重要应用价值。
2.关键词（中文）
防腐、抗菌药物耐药性、消毒、钩端螺旋体、氯己定、西曲溴铵
3.研究目的
针对当前抗菌药物耐药性日益严峻、生物膜相关感染难以清除的公共卫生问题，系统评估葡萄糖酸氯己定与西曲溴铵联合的体外协同抗菌和抗生物膜潜力，明确其对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的作用类型及有效浓度范围。同时，全面验证含该联合的市售制剂对广谱微生物（包括耐药菌、厌氧菌、分枝杆菌、真菌及病毒）的杀灭效果，特别是对临床关注的钩端螺旋体等特殊病原体的活性，为该经典组合在医疗、个人护理及公共卫生领域的持续合理应用提供科学依据。
4.研究思路
首先采用微量肉汤稀释法测定CHG和CTR单独对铜绿假单胞菌ATCC 15442和金黄色葡萄球菌ATCC 6538P的最低抑菌浓度（MIC）。通过棋盘法设计不同浓度组合，计算分数抑菌浓度指数（FICI），判定两者的相互作用类型（协同、加性、无关或拮抗），并通过FIC双轴图分析协同作用的方向性。
其次，采用结晶紫染色法定量评估亚抑菌浓度下CHG-CTR联合对细菌生物膜形成的影响，计算特异性生物膜形成量和粘附指数，结合明场显微镜和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对生物膜形态和生物量进行定性和三维定量分析。
然后，利用刃天青代谢活性实验和Calgary生物膜装置（CBD）测定联合对预形成生物膜的最小生物膜根除浓度（MBEC），通过CLSM活/死染色评估生物膜内细胞的存活率。同时，通过微生物粘附烃类（MATH）实验、运动性实验和刚果红结合实验，初步探索联合抑制生物膜形成的潜在机制。
最后，按照国际标准方法（BS EN1276、EN1656、EN14476等），评估含1.5% CHG和3.0% CTR的市售制剂对细菌、真菌、病毒及钩端螺旋体的接触杀灭效果，包括1分钟常规杀灭、10秒快速杀灭及不同接触时间的灭活效率。
5.研究亮点
首次系统量化了CHG与CTR联合对铜绿假单胞菌的协同抗菌效应（FICI最低达0.125），明确了两者在抗革兰氏阴性菌中的浓度依赖协同关系，为降低抗菌剂使用浓度、减少潜在刺激性提供了依据。
证实亚抑菌浓度下的CHG-CTR联合可显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的初始粘附和形成，且对两种细菌的预成熟生物膜均具有良好的根除效果，解决了单一抗菌剂对生物膜活性不足的问题。
全面覆盖了临床最具威胁的微生物谱，包括ESKAPE耐药病原体、厌氧菌、分枝杆菌、致病性钩端螺旋体、致病真菌及多种RNA/DNA病毒，首次证实该制剂对钩端螺旋体的高效杀灭作用（>99.9%杀灭率），拓展了其应用场景。
采用多技术交叉验证体系，从浮游菌抑制、生物膜形成阻断、预形成生物膜根除到广谱微生物杀灭，结合定量生化测定和可视化显微分析，数据可靠性高，结论说服力强。
针对后疫情时代的感染防控需求，重新验证了经典消毒组合的有效性，证实其在耐药菌流行背景下仍具有不可替代的应用价值，为临床和公共卫生消毒策略提供了科学支撑。
6.可延伸的方向
深入解析CHG与CTR协同抗菌的分子机制，通过转录组学、蛋白质组学技术揭示两者在细胞膜破坏、能量代谢抑制及基因表达调控等层面的协同作用靶点。
评估该联合制剂对临床分离的多重耐药菌株（如碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌、万古霉素耐药肠球菌）生物膜的根除效果，特别是对医疗植入物相关生物膜的作用。
开展体内动物实验，验证该制剂在皮肤伤口感染、烧伤感染等模型中的体内抗菌和抗生物膜效果，同时评估其皮肤刺激性、毒性及长期使用的安全性。
优化制剂配方，如添加生物粘附剂、保湿剂或纳米载体，提高其在皮肤、黏膜及物体表面的滞留时间和渗透能力，进一步增强抗菌和抗生物膜效果。
研究该联合制剂与抗生素、噬菌体或植物提取物的协同作用，开发多靶点抗菌策略，应对日益严重的抗菌药物耐药性问题。
评估长期低浓度暴露下该联合制剂对微生物耐药性发展的影响，建立耐药性监测模型，为其合理使用和轮换策略提供指导。
7.测量的数据及其研究意义
单独最低抑菌浓度（MIC）数据：来自表1和表2，测定了CHG和CTR单独对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的MIC值。研究意义：明确了两种抗菌剂单独的抗菌活性基线，为后续棋盘法协同实验的浓度设计提供了基础依据。
分数抑菌浓度指数（FICI）数据：来自表1、表2和图S1，包含不同浓度组合下的FIC值及相互作用判定结果，以及FIC双轴分布图。研究意义：定量证实了CHG与CTR联合对铜绿假单胞菌的协同抗菌作用（FICI≤0.5），对金黄色葡萄球菌的加性效应，并明确了协同作用的浓度范围和两者的贡献度。
金黄色葡萄球菌生物膜形成数据：来自图1a、1b、1c，包括不同浓度下的特异性生物膜形成量、粘附指数及结晶紫染色明场显微图像。研究意义：定量和定性证实了亚抑菌浓度下CHG-CTR联合可显著降低金黄色葡萄球菌的生物膜粘附能力，为预防生物膜相关感染提供了实验依据。
金黄色葡萄球菌生物膜CLSM数据：来自图2a-e，包括生物膜Z-stack三维图像、相对荧光单位（RFU）及生物体积定量结果。研究意义：从三维结构层面直观展示了联合处理后生物膜生物量的显著减少，验证了结晶紫染色的定量结果，提供了更直观的形态学证据。
预形成生物膜代谢活性数据：来自图3a、3b，为不同浓度CHG-CTR处理后刃天青实验的相对荧光单位热图。研究意义：定量评估了联合对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌预形成生物膜细胞代谢活性的抑制作用，初步确定了最小生物膜根除浓度（MBEC）的范围。
预形成生物膜细胞活力数据：来自图4a-d，包括CLSM活/死染色图像及Syto9/PI荧光比值定量结果。研究意义：直接证实了CHG-CTR联合可显著降低生物膜内活细胞的比例，直观展示了其生物膜根除效果，弥补了代谢活性测定的局限性。
细胞表面特性数据：来自图S3，为不同处理组的细胞表面疏水性（CSH）百分比。研究意义：排除了细胞表面疏水性改变作为联合抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机制，同时结合运动性和刚果红结合实验结果，提示联合可能通过影响细菌表面电荷或初始粘附的物理化学作用发挥效应。
广谱细菌杀灭数据：来自表3，包含多种临床相关细菌（革兰氏阳性/阴性、耐药菌、厌氧菌、分枝杆菌）的稀释度、接触时间及log10杀灭值。研究意义：全面证实了市售制剂对广谱细菌的高效杀灭效果，特别是对ESKAPE病原体、MRSA、VRE及结核分枝杆菌的活性，为其在医疗环境消毒中的应用提供了数据支持。
快速杀灭数据：来自表4，为10秒接触时间内对常见致病菌的log10杀灭值。研究意义：证实了该制剂的快速杀菌能力，满足了手卫生、紧急消毒等场景下的快速防控需求。
抗真菌活性数据：来自表5，包含念珠菌属、隐球菌属及马拉色菌属的杀灭效果。研究意义：拓展了制剂的应用范围，证实其对皮肤黏膜常见致病真菌的有效性，可用于真菌感染相关的消毒和护理。
抗病毒活性数据：来自表6，为对多种DNA和RNA病毒（包括HIV、SARS-CoV-2、诺如病毒等）的灭活效果。研究意义：证实了制剂对病毒的广谱灭活能力，特别是对呼吸道和肠道传播病毒的活性，为呼吸道传染病和食源性病毒感染的防控提供了手段。
抗钩端螺旋体数据：来自流式细胞术活/死染色结果，为5分钟接触后的杀灭率。研究意义：首次证实该经典消毒组合对致病性钩端螺旋体的高效杀灭作用，填补了该领域的研究空白，为钩端螺旋体病的环境防控提供了新的选择。
8.结论
本研究系统证实了葡萄糖酸氯己定与西曲溴铵的经典联合具有优异的体外协同抗菌和抗生物膜活性：对铜绿假单胞菌表现为显著的协同抗菌作用，可使两者的MIC降低4倍以上；对金黄色葡萄球菌表现为加性效应，且亚抑菌浓度下可显著抑制其生物膜的初始粘附和形成。同时，该联合对两种细菌的预形成生物膜均具有良好的根除效果，可显著降低生物膜内细胞的代谢活性和存活率。
含1.5% CHG和3.0% CTR的市售制剂具有超广谱的生物杀灭活性，对包括ESKAPE耐药病原体、MRSA、VRE、厌氧菌、结核分枝杆菌、致病性钩端螺旋体在内的多种细菌，以及念珠菌、隐球菌等真菌和HIV、SARS-CoV-2、诺如病毒等多种病毒均具有高效杀灭效果，且可在10秒内实现对常见致病菌的快速杀灭。
在当前抗菌药物耐药性日益严重、生物膜相关感染频发的背景下，CHG与CTR的经典联合仍具有不可替代的应用价值，可广泛应用于医疗环境消毒、皮肤黏膜防腐、伤口护理及公共卫生感染防控等多个领域。
9.芬兰Bioscreen仪器相关测量数据的研究意义
本研究中使用标注为“Bioscreen”的Tecan Infinite M Plex多功能酶标仪进行了刃天青荧光强度的测定，用于评估预形成生物膜内细菌细胞的代谢活性。虽然本研究未直接使用该仪器进行微生物生长曲线的连续监测，但结合该仪器的技术特点及抗菌研究的常规应用，其研究意义可从以下两方面解读：
本研究中的实际应用意义：该仪器通过高精度的荧光检测系统，实现了对96孔板中大量样品的同时快速测定，准确量化了不同浓度CHG-CTR处理后生物膜细胞的代谢活性变化。与传统的平板计数法相比，该方法具有高通量、高灵敏度、操作简便的优势，可在短时间内获得大量可靠数据，为快速筛选有效的生物膜根除浓度提供了技术支撑。同时，仪器内置的恒温控制和自动振荡功能，保证了所有样品在相同的培养和反应条件下进行测定，显著提高了实验的重复性和组间可比性。
微生物生长曲线测量的通用研究意义：芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪作为微生物学研究的经典仪器，其核心功能是通过连续监测光密度（OD）值，实时绘制微生物的生长曲线。在抗菌剂研究中，该仪器可用于：① 动态监测抗菌剂对微生物生长动力学的影响，准确测定MIC、最低杀菌浓度（MBC）及生长抑制率，比终点法更能反映抗菌剂的作用时效和强度；② 评估亚抑菌浓度下抗菌剂对微生物生长的延迟作用或亚致死效应，为研究抗菌剂的作用机制提供动态数据；③ 高通量筛选不同抗菌剂组合的协同或拮抗作用，通过生长曲线的差异快速判定相互作用类型；④ 研究微生物在不同环境条件下的生长特性，为抗菌剂的应用场景优化提供依据。
在本研究的体系中，若使用该仪器进行生长曲线测定，可进一步动态追踪CHG-CTR联合对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生长过程的影响，明确协同作用发生的时间节点，以及不同浓度组合对细菌延迟期、对数期和稳定期的调控作用，为更深入理解两者的协同机制提供更全面的动力学数据。