Preparation of Alginate/AgNP Nanocomposite Hydrogels Incorporating Olive Leaf Extracts in Natural Deep Eutectic Solvents
在天然深共晶溶剂中掺入橄榄叶提取物的海藻酸盐/银纳米颗粒纳米复合水凝胶的制备
来源：Polymers 2025, 17, 3234.
1.摘要
本研究开发了一种创新的绿色合成路线，制备具有抗菌活性的海藻酸盐-银纳米颗粒（Alg-AgNP）纳米复合水凝胶。采用由葡萄糖、乳酸和水组成的任务特异性天然深共晶溶剂（NADES）作为绿色溶剂提取橄榄叶中的生物活性成分，所得NADES-橄榄叶提取物（NADES-OLE）同时发挥三重作用：作为海藻酸盐水凝胶的交联剂、水凝胶形成过程中原位合成银纳米颗粒（AgNPs）的还原剂，以及因富含橄榄叶活性成分而成为生物活性增强剂。通过Box-Behnken实验设计优化了纳米复合水凝胶的制备工艺，所得水凝胶在pH 5.5的磷酸盐缓冲液中180分钟内溶胀率达538%，250分钟后保水率仍为90%。水凝胶中原位生成的AgNPs平均粒径为103.2 ± 5.6 nm，浓度为1.2×10⁸ ± 2.2×10⁷个/mL。抗菌测试显示，1 mg/mL浓度的纳米复合水凝胶对大肠杆菌（64.9%）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（60.6%）、金黄色葡萄球菌（79.1%）和蜡样芽孢杆菌（55.3%）等食源性致病菌具有显著抗菌活性。
2.关键词（中文）
银纳米颗粒、纳米复合水凝胶、天然深共晶溶剂、抗菌活性、绿色纳米技术
3.研究目的
针对传统银纳米颗粒水凝胶制备过程中使用有毒化学还原剂、交联剂，以及工艺复杂、可持续性差的问题，开发一种全绿色的一锅法合成策略。利用任务特异性设计的天然深共晶溶剂提取农业废弃物橄榄叶中的生物活性成分，实现NADES-OLE的多功能集成，原位合成兼具优异溶胀性能、保水性能和广谱抗菌活性的Alg-AgNP纳米复合水凝胶。通过响应面法系统优化制备工艺，为其在伤口敷料、食品保鲜等生物医药和食品领域的应用提供理论基础和技术支撑，同时实现农业废弃物的高值化利用，符合循环经济和绿色化学理念。
4.研究思路
首先设计并制备由葡萄糖、D,L-乳酸和水按1:5:6.2摩尔比组成的任务特异性NADES，采用超声辅助提取法提取橄榄叶中的多酚和黄酮类生物活性成分，通过福林-酚法和氯化铝比色法测定提取物的总酚和总黄酮含量。然后以NADES-OLE为多功能组分，结合海藻酸钠和硝酸银，在太阳光辅助下一锅法同时完成AgNPs的还原和海藻酸盐水凝胶的交联。采用三因素三水平的Box-Behnken实验设计，以硝酸银浓度、NADES-OLE含量和搅拌时间为自变量，以溶胀率和保水率为响应值，建立数学模型并优化制备工艺，通过验证实验确认模型可靠性。通过UV-Vis光谱、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、Zeta电位、透射电子显微镜（TEM）结合能谱分析（EDS）等手段，系统表征水凝胶的理化性质以及AgNPs的形貌、尺寸、分布、元素组成和胶体稳定性。最后采用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，通过自动比浊法测试纳米复合水凝胶对多种革兰氏阴性和阳性食源性致病菌的抗菌活性，评估其应用潜力。
5.研究亮点
首次实现了NADES-OLE的三重功能集成：同时作为海藻酸盐水凝胶的交联剂、银纳米颗粒的绿色还原剂和水凝胶的生物活性增强剂，完全避免了有毒化学试剂的使用，简化了合成工艺，显著提升了过程的绿色性和可持续性。
创新采用一锅法原位合成策略，利用可再生太阳能作为光化学还原的能源，在室温下同时完成AgNPs的生成和水凝胶的交联，降低了能耗，符合绿色化学原则。
实现了农业废弃物橄榄叶的高值化利用，同时NADES对提取物中多酚、黄酮等生物活性成分具有保护和稳定作用，提升了水凝胶的生物活性和长期稳定性。
通过响应面法系统优化了制备工艺，获得了兼具高溶胀率（538%）、高保水率（90%）和广谱抗菌活性的纳米复合水凝胶，其性能满足伤口敷料对湿润微环境和抗菌功能的核心需求。
系统表征证实了AgNPs在水凝胶基质中具有良好的分散性和优异的胶体稳定性（Zeta电位-38.7 mV），为其持续释放和长效抗菌提供了保障。
6.可延伸的方向
进一步优化NADES的组成配比和超声辅助提取工艺，提高橄榄叶中生物活性成分的提取率，探索不同植物来源（如茶叶、葡萄籽）提取物对水凝胶性能的调控作用。
研究纳米复合水凝胶的药物负载和控释性能，负载生长因子、抗生素等药物，开发兼具抗菌、抗炎和促伤口愈合功能的多功能智能伤口敷料。
开展细胞毒性、血液相容性和体内动物实验，系统评估水凝胶的生物安全性和体内抗菌效果，为其临床转化提供数据支持。
探索该纳米复合水凝胶在食品保鲜（如肉类、果蔬保鲜）、水质净化、医用纺织品抗菌等领域的应用潜力，拓展其应用范围。
深入研究AgNPs与橄榄叶提取物中多酚、黄酮类成分的协同抗菌分子机制，为进一步提升水凝胶的抗菌性能、降低银纳米颗粒用量提供理论指导。
开发可注射、自愈合、pH响应或温度响应型的Alg-AgNP纳米复合水凝胶，满足不同应用场景的个性化需求。
7.测量的数据及其研究意义
橄榄叶提取物总酚和总黄酮含量数据：总酚含量为31.50 ± 1.03 mg GAE/g干重，总黄酮含量为11.93 ± 0.25 mg CAT/g干重。研究意义：证实葡萄糖-乳酸-水NADES能够高效提取橄榄叶中的多酚和黄酮类生物活性成分，为其后续作为还原剂和生物活性增强剂提供了物质基础。
水凝胶制备过程颜色变化数据：来自图2，显示0-120分钟内反应体系从无色逐渐变为深紫色/棕色。研究意义：直观证明了AgNPs的原位生成，颜色变化与AgNPs的形成和浓度增加正相关，为反应进程的监测提供了简单有效的可视化方法。
Box-Behnken实验设计原始数据：来自表2，包含15组实验的自变量水平及对应的溶胀率和保水率结果。研究意义：为建立制备工艺参数与水凝胶性能之间的二次数学模型提供了实验基础，通过方差分析确定了各因素及交互作用对响应值的影响显著性。
溶胀率响应面图：来自图5，展示了硝酸银浓度与NADES-OLE含量、搅拌时间与NADES-OLE含量、搅拌时间与硝酸银浓度的交互作用对溶胀率的影响。研究意义：直观呈现了各因素对水凝胶溶胀性能的影响规律，发现较低的NADES-OLE含量和较长的搅拌时间有利于提高溶胀率。
保水率响应面图：来自图6，展示了硝酸银浓度与NADES-OLE含量、搅拌时间与NADES-OLE含量的交互作用对保水率的影响。研究意义：明确了较高的NADES-OLE含量和适中的搅拌时间有利于提升水凝胶的保水性能，为工艺优化提供了可视化依据。
模型验证数据：来自表5，显示最优条件（5 mM硝酸银、4% v/v NADES-OLE、搅拌4.5小时）下实验测得的溶胀率（437.50%）和保水率（87.00%）落在模型95%预测区间内。研究意义：验证了所建立的响应面模型的准确性和可靠性，确保了最优制备工艺的可重复性和实用性。
UV-Vis吸收光谱数据：来自图4，显示含AgNPs的水凝胶在420 nm处有特征表面等离子体共振（SPR）吸收峰，且峰强度随硝酸银浓度增加而增强，空白水凝胶无此吸收峰。研究意义：从分子水平证实了AgNPs的成功合成，特征峰位置表明生成的AgNPs主要为球形，峰强度与AgNPs浓度正相关。
纳米颗粒跟踪分析（NTA）数据：来自图7，显示AgNPs的平均 hydrodynamic 粒径为103.2 ± 5.6 nm，浓度为1.2×10⁸ ± 2.2×10⁷个/mL，粒径分布较窄。研究意义：准确测定了AgNPs的粒径分布和浓度，证实其粒径均一，处于适合抗菌应用的纳米尺度范围。
Zeta电位数据：AgNPs的Zeta电位为-38.7 ± 1.3 mV。研究意义：表明AgNPs表面带强负电荷，具有优异的胶体稳定性，不易发生团聚，有利于其在水凝胶基质中的长期稳定存在和持续释放。
溶胀率和保水率对比数据：来自图8，对比了含AgNPs的纳米复合水凝胶和仅含NADES的水凝胶的溶胀和保水性能。研究意义：明确了AgNPs的掺入使水凝胶的溶胀过程更可控，同时显著提升了保水性能，证实AgNPs参与了水凝胶网络的交联和强化。
透射电子显微镜（TEM）图像：来自图9和图10，显示AgNPs的核心尺寸为10-20 nm，形貌包括球形、三角形和六边形，在水凝胶基质中分散性良好，仅有少量团聚。研究意义：直观观察了AgNPs在水凝胶内部的形貌、尺寸和分布，证实NADES-OLE和海藻酸钠起到了良好的稳定和分散作用。
能谱分析（EDS）数据：来自图11和表6，显示AgNPs区域在3 keV处有银的特征吸收峰，半定量分析显示银元素含量最高。研究意义：从元素组成层面证实了生成的纳米颗粒为金属银，同时检测到碳、氧、钠等元素，来自海藻酸钠和NADES-OLE的包覆层。
细菌生长曲线数据：来自图12，显示了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在空白组、NADES水凝胶组、NADES-OLE水凝胶组和纳米复合水凝胶组中的生长曲线。研究意义：直观展示了不同水凝胶对细菌生长的抑制效果，证实纳米复合水凝胶的抗菌活性显著优于单一组分水凝胶。
抗菌活性定量数据：来自表7和表8，列出了不同水凝胶对5种致病菌的生长速率和抑菌率。研究意义：定量评估了纳米复合水凝胶的广谱抗菌活性，证实了AgNPs、NADES和橄榄叶提取物之间存在协同抗菌作用，为其抗菌应用提供了直接的定量证据。
8.结论
本研究成功开发了一种全绿色、可持续的一锅法合成策略，利用葡萄糖-乳酸-水组成的任务特异性NADES提取橄榄叶中的生物活性成分，并将NADES-OLE作为交联剂、还原剂和生物活性增强剂，在太阳光辅助下原位合成了Alg-AgNP纳米复合水凝胶。通过Box-Behnken实验设计优化得到最优制备工艺：5 mM硝酸银、4% v/v NADES-OLE、搅拌4.5小时。最优条件下的纳米复合水凝胶具有优异的溶胀性能（180分钟达538%）和保水性能（250分钟保水率90%），能够为伤口愈合提供持续的湿润微环境。原位生成的AgNPs平均 hydrodynamic 粒径为103.2 nm，核心尺寸10-20 nm，表面带强负电荷，在水凝胶基质中分散性好、稳定性高。抗菌测试表明，1 mg/mL的纳米复合水凝胶对大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌等食源性致病菌具有显著的广谱抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑制率最高达79.1%。该研究为农业废弃物的高值化利用和绿色纳米抗菌材料的开发提供了新的思路，所制备的纳米复合水凝胶在伤口敷料、食品保鲜等领域具有广阔的应用前景。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析系统，通过自动比浊法测定了纳米复合水凝胶对多种食源性致病菌的抗菌活性，其研究意义主要体现在以下方面：
高通量并行检测：该仪器支持100孔蜂窝板同时检测，可并行分析纳米复合水凝胶、仅含NADES的水凝胶、含NADES-OLE的水凝胶及空白对照组对5种致病菌的抗菌活性，大幅提高了实验效率，减少了人工操作带来的误差，能够在短时间内获得大量可靠数据。
动态连续监测生长过程：每隔30分钟自动读取600 nm处的光密度（OD₆₀₀）值，连续监测48小时，能够完整记录细菌生长的延迟期、对数期、稳定期和衰亡期，准确反映水凝胶对细菌生长动力学的影响。与传统的终点平板计数法相比，能够捕捉到细菌生长的动态变化，更全面地评估抗菌材料的作用效果。
标准化实验条件控制：仪器内置精确的恒温培养系统（37℃）和自动振荡功能，保证所有样品在相同的温度、通气和搅拌条件下培养，消除了环境因素对实验结果的影响，提高了不同菌株、不同处理组之间数据的可比性和实验的可重复性。
准确定量抗菌活性：通过配套的ComBase工具DMFit对生长曲线进行拟合，计算得到细菌的最大生长速率，进而准确量化水凝胶的抑菌率。本研究通过该方法得到了纳米复合水凝胶对大肠杆菌（64.9%）、金黄色葡萄球菌（79.1%）等致病菌的精确抑制率，为评估其抗菌性能提供了客观、定量的数据支持，避免了主观判断带来的偏差。
验证协同抗菌作用：通过对比纳米复合水凝胶、NADES水凝胶和NADES-OLE水凝胶的抗菌活性，发现纳米复合水凝胶的抑菌率显著高于后两者之和，证实了AgNPs、NADES中的乳酸以及橄榄叶提取物中的多酚、黄酮类成分之间存在协同抗菌作用，为理解水凝胶的抗菌机制提供了实验依据。
高灵敏度检测：仪器的光学检测系统具有高灵敏度，能够准确检测低浓度细菌的OD值变化，即使在抗菌效果较强、细菌生长受到显著抑制的情况下，也能获得可靠的生长曲线数据，确保了抗菌活性评估的准确性。