The resilience of Salmonella to bile stress is impaired due to the reduced efflux pump activity mediated by the antioxidant enzyme YqhD
由于抗氧化酶YqhD介导的外排泵活性降低，沙门氏菌对胆汁应激的耐受性受损
来源：October 2025 Volume 10 Issue 10 10.1128/msphere.00382-25
1.摘要
胆汁盐通过破坏细菌膜结构和产生活性氧（ROS）发挥抗菌作用，沙门氏菌可通过调节代谢活动抵抗胆汁损伤。本研究探究了醛还原酶YqhD在鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌胆汁敏感性中的作用。结果显示，yqhD基因缺失突变体在添加胆汁的LB培养基、HepG2肝细胞系及经8%胆酸钠处理的C57BL/6小鼠盲肠中存活率显著升高；高脂饮食（HFD）诱导胆汁分泌增加后，yqhD突变体在小鼠肝脏和脾脏的器官负担显著上升。胆汁暴露下，yqhD突变体胞内ROS水平升高，同时抗氧化基因表达发生调控性改变；添加抗氧化剂谷胱甘肽可使野生型沙门氏菌存活率提升至与突变体相当水平。在NADPH氧化酶缺陷的gp91phox-/-小鼠中，高脂饮食不再增加yqhD突变体的器官负担和病理损伤。机制研究表明，yqhD缺失通过RamA/R调控子上调AcrAB外排泵活性，从而增强沙门氏菌的胆汁抗性。本研究首次揭示了抗氧化酶YqhD通过调控外排泵活性影响沙门氏菌胆汁耐受性的新机制，为解决沙门氏菌慢性携带问题提供了重要见解。
2.关键词（中文）
沙门氏菌致病机制、胆汁应激、YqhD基因、氧化还原
3.研究目的
针对沙门氏菌耐受高浓度胆汁并在胆囊中长期定植导致慢性感染的公共卫生问题，以及高脂饮食加剧沙门氏菌肠道定植的现象，阐明抗氧化酶YqhD在沙门氏菌胆汁应激响应中的功能及分子机制，明确YqhD与外排泵系统、氧化应激之间的调控关系，揭示高脂饮食通过胆汁影响沙门氏菌致病性的具体途径，为开发靶向沙门氏菌胆汁抗性的新型防控策略提供理论依据。
4.研究思路
首先通过qRT-PCR检测胆汁处理下沙门氏菌野生型中yqhD的表达变化，利用λ-red重组酶系统构建yqhD敲除株（STM ΔyqhD）和回补株（STM ΔyqhD:yqhD），验证基因缺失不影响菌株正常生长。随后在体外（7%混合胆汁盐、1%脱氧胆酸钠）、细胞水平（HepG2肝细胞、RAW264.7巨噬细胞）和动物水平（C57BL/6小鼠、gp91phox-/-小鼠，普通饮食/高脂饮食）系统比较野生型和突变体的存活率、细胞内增殖能力及器官负担。通过DCFDA染色检测胞内ROS水平，qRT-PCR分析抗氧化基因和胆汁响应基因的表达，结合谷胱甘肽处理实验验证氧化应激的作用。进一步检测外排泵相关基因（acrR、acrB）的表达，利用外排泵抑制剂CCCP和acrB双敲除菌株验证AcrAB外排泵的功能；最后通过ramA和soxR/S敲除实验，明确RamA/R调控子在YqhD介导的胆汁抗性中的核心作用。
5.研究亮点
首次发现抗氧化酶YqhD对沙门氏菌胆汁抗性具有负调控作用，打破了“抗氧化基因均有利于细菌抵抗环境应激”的传统认知，揭示了氧化应激在细菌胆汁抗性中的双重作用。
阐明了“YqhD缺失→ROS升高→RamA上调→AcrAB外排泵激活→胆汁外排增加→沙门氏菌胆汁抗性增强”的完整分子通路，建立了氧化应激与外排泵调控之间的新联系。
模拟临床高脂饮食场景，证实高脂饮食通过增加胆汁分泌显著提升yqhD突变体的体内致病性，为解释高脂饮食人群沙门氏菌感染风险升高提供了新的机制解释。
利用gp91phox-/-小鼠模型，明确了宿主来源的氧化应激是yqhD突变体在高脂饮食下致病的关键因素，为宿主-病原体相互作用研究提供了新视角。
6.可延伸的研究方向
深入解析YqhD调控RamA表达的具体分子机制，明确YqhD是否通过直接相互作用或间接代谢产物影响RamA的转录或活性。
探究YqhD在其他肠道致病菌（如大肠杆菌、志贺氏菌）胆汁抗性中的保守性，验证该调控机制的普适性。
研究临床分离的慢性携带沙门氏菌菌株中yqhD基因的表达水平与胆汁抗性、定植能力的相关性，为临床防控提供生物标志物。
开发靶向YqhD或RamA-AcrAB通路的小分子抑制剂，与抗生素联合使用，增强对胆汁抗性沙门氏菌的清除效果。
探究肠道菌群代谢产物对沙门氏菌yqhD表达及胆汁抗性的影响，揭示肠道微环境与病原体互作的新机制。
评估yqhD缺失对沙门氏菌在胆囊中长期定植能力的影响，为解决慢性携带问题提供新的干预靶点。
7.测量的数据及其研究意义
yqhD基因表达数据：来自图1A和图1E，包括LB培养基中不同时间点及胆汁处理后、HepG2细胞感染后yqhD的mRNA表达水平。研究意义：证实胆汁应激下沙门氏菌主动下调yqhD表达以适应环境，为后续功能研究提供了表达基础。
体外胆汁敏感性数据：来自图1B、1C、1D，包括野生型、yqhD敲除株和回补株在7%混合胆汁盐、1%脱氧胆酸钠处理后的存活率。研究意义：直接证明yqhD缺失显著增强沙门氏菌对初级和次级胆汁盐的抗性，且该表型可通过基因回补逆转。
肝细胞内增殖数据：来自图1F和1G，包括HepG2细胞中野生型、突变体及CYP7A1敲低后菌株的增殖倍数。研究意义：证实肝细胞内胆汁环境有利于yqhD突变体增殖，且CYP7A1介导的胆汁合成是该表型的关键因素。
小鼠肠道定植数据：来自图1H，包括8%胆酸钠处理后小鼠回肠、盲肠和粪便中的细菌载量。研究意义：在体内验证了yqhD缺失增强沙门氏菌对胆汁的抗性，且盲肠是突变体定植优势最显著的部位。
高脂饮食下器官负担数据：来自图2A，包括普通饮食和高脂饮食下小鼠肝脏和脾脏的细菌载量。研究意义：揭示高脂饮食通过增加胆汁分泌，消除了yqhD突变体在系统性感染中的劣势，使其致病性与野生型相当。
小鼠肝脏yqhD表达数据：来自图2B，包括高脂饮食和普通饮食下感染小鼠肝脏中野生型沙门氏菌的yqhD表达水平。研究意义：体内验证了高脂饮食诱导的胆汁环境下调沙门氏菌yqhD表达，与体外实验结果一致。
脾脏长度和病理数据：来自图2C、2E、2F，包括不同饮食下小鼠脾脏长度及肝脏组织的病理评分。研究意义：从组织病理学层面证实高脂饮食加剧yqhD突变体感染的严重程度，与器官负担数据相互印证。
巨噬细胞内增殖数据：来自图3A，包括RAW264.7细胞、C57BL/6和gp91phox-/-小鼠腹腔巨噬细胞中菌株的增殖倍数。研究意义：证实YqhD有助于沙门氏菌抵抗巨噬细胞内的氧化应激，而宿主NADPH氧化酶产生的ROS是限制yqhD突变体增殖的关键因素。
抗氧化基因表达数据：来自图3B和3D，包括巨噬细胞内及胆汁处理后菌株的katA、katG、sodA、sodB等基因的表达水平。研究意义：揭示yqhD缺失后沙门氏菌通过上调超氧化物歧化酶基因（sodA、sodB）应对胆汁诱导的氧化应激。
胞内ROS水平数据：来自图3C，包括胆汁处理后野生型、突变体和回补株的DCFDA荧光强度。研究意义：直接证明yqhD缺失导致胆汁处理下胞内ROS水平显著升高，为氧化应激介导的表型提供了直接证据。
谷胱甘肽处理实验数据：来自图3E，包括添加谷胱甘肽后菌株在胆汁中的存活率。研究意义：证实降低氧化应激可消除yqhD突变体的胆汁存活优势，明确氧化应激是该表型的核心机制。
gp91phox-/-小鼠感染数据：来自图4A、4B、4C、4D、4E，包括不同饮食下小鼠的器官负担、脾脏长度、体重变化及肝脏病理评分。研究意义：在体内验证宿主来源的ROS是高脂饮食下yqhD突变体致病性增强的必要条件。
胆汁响应基因表达数据：来自图5A和5B，包括胆汁处理后及HepG2细胞感染后外排泵、孔蛋白、DNA损伤相关基因的表达水平。研究意义：筛选出yqhD缺失后显著下调的外排泵抑制基因acrR，为外排泵机制研究指明了方向。
acrB基因表达数据：来自图5C和5G，包括胆汁处理、谷胱甘肽处理后acrB的mRNA表达水平。研究意义：证实yqhD缺失通过上调acrB表达增强外排泵活性，且该上调不依赖于ROS水平。
外排泵抑制剂实验数据：来自图5D，包括添加CCCP后菌株在胆汁中的存活率。研究意义：药理学验证AcrAB外排泵活性是yqhD突变体胆汁存活优势的关键。
双敲除菌株表型数据：来自图5E和5F，包括STM ΔacrB ΔyqhD双敲除株的体外胆汁存活率和HepG2细胞内增殖能力。研究意义：遗传学证实acrB是yqhD介导胆汁抗性的下游关键基因。
调控子基因表达及敲除数据：来自图5H、5I、5J，包括ramA和soxR的表达水平，以及ramA、soxR/S敲除后菌株的细胞内增殖能力和ramA表达变化。研究意义：明确RamA/R调控子是介导YqhD-AcrAB通路的核心转录因子，且其激活部分依赖于ROS。
8.结论
本研究系统阐明了抗氧化酶YqhD负向调控沙门氏菌胆汁耐受性的分子机制。YqhD作为NADPH依赖的醛还原酶，其缺失导致沙门氏菌胞内ROS水平升高，进而通过部分依赖ROS的方式上调转录因子RamA的表达；RamA结合并激活AcrAB外排泵的转录，增强细菌对胆汁盐的外排能力，最终提高沙门氏菌在胆汁环境中的存活率。在体内，高脂饮食诱导肝脏胆汁分泌增加，一方面通过下调沙门氏菌yqhD表达解除其对外排泵的抑制，另一方面为yqhD突变体提供了有利的胆汁环境，使其在肝脏和脾脏的器官负担及病理损伤显著升高，达到与野生型相当的致病性。此外，宿主巨噬细胞通过NADPH氧化酶产生的ROS是限制yqhD突变体系统性感染的关键因素，在氧化应激缺陷的gp91phox-/-小鼠中，yqhD突变体的致病优势完全消失。本研究不仅揭示了沙门氏菌胆汁抗性调控的新通路，也为高脂饮食与沙门氏菌感染的关联提供了机制解释，为开发针对慢性沙门氏菌感染的新型干预策略奠定了基础。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析系统，在细菌培养方法部分，通过连续24小时监测600 nm处的光密度（OD600）值，绘制了沙门氏菌野生型、yqhD敲除株及其他衍生菌株在LB培养基中的生长曲线。其研究意义主要体现在以下方面：
验证菌株生长表型一致性：通过生长曲线对比，证实yqhD基因的缺失及其他基因（acrB、ramA、soxR/S）的敲除均未导致沙门氏菌在正常LB培养基中出现生长缺陷，排除了菌株本身生长能力差异对后续胆汁敏感性、细胞内增殖及动物感染实验结果的干扰，确保所有表型差异均由基因功能缺失及胆汁处理引起。
标准化实验起始条件：基于生长曲线确定了菌株的对数生长期时间点，为后续所有实验（如胆汁处理、细胞感染、RNA提取）的菌液制备提供了统一的标准，保证了实验的可重复性和组间可比性。
高通量与自动化优势：该仪器支持100孔微量板同时检测，可并行分析多个菌株的生长情况，大幅提高了实验效率，减少了人工操作带来的误差；内置的恒温振荡系统确保了所有样品在相同的培养条件下生长，进一步提升了数据的可靠性。
动态监测生长过程：与传统的终点平板计数法相比，Bioscreen C能够实时记录细菌生长的延迟期、对数期、稳定期和衰亡期的完整动态变化，可更全面地评估基因缺失对细菌生长动力学的影响，及时发现潜在的生长表型差异。
为后续实验浓度设定提供依据：通过生长曲线确定了菌株的最大OD600值和倍增时间，为后续胆汁处理实验中菌液浓度的调整、感染复数（MOI）的设定提供了准确的参考依据。