Isolation and characterization of Salmonella phages for controlling bacterial infections
用于控制细菌感染的沙门氏菌噬菌体的分离与表征
来源：Front. Vet. Sci. 12:1695255.
1. 摘要
多重耐药肠炎沙门氏菌的流行对公共卫生、兽医和食品安全构成严重威胁，噬菌体因其宿主特异性、不破坏共生菌群的特性成为抗生素的理想替代品。本研究从中国不同地理区域的多样环境样本中分离得到12株沙门氏菌特异性噬菌体，筛选出4株具有广谱宿主范围的烈性噬菌体（DN01、DN03、DN19、DN28）进行系统表征。通过测定其最佳感染复数、潜伏期、裂解量、pH和热稳定性、抗生物膜活性，结合透射电镜形态观察、全基因组测序和系统发育分析评估其生物学特性与遗传安全性，并通过小鼠感染模型验证体内治疗效果。结果显示，4株噬菌体对包括多重耐药菌株在内的多种沙门氏菌血清型具有强效裂解活性，最佳MOI低至0.00001，潜伏期10-20分钟，在pH3-11和4-50℃范围内保持稳定；基因组不含溶原、毒力或抗生素耐药相关基因；体外能显著抑制细菌生长并破坏成熟生物膜；小鼠体内实验中，噬菌体治疗显著提高感染小鼠存活率，其中四株噬菌体组成的鸡尾酒实现100%存活率。研究表明，这些噬菌体尤其是鸡尾酒制剂，是控制多重耐药肠炎沙门氏菌感染的安全、稳定且有效的生物制剂。
2. 关键词
肠炎沙门氏菌、多重耐药、噬菌体、噬菌体鸡尾酒、噬菌体疗法、生物膜
3. 研究目的
从中国不同生态环境中分离筛选对多重耐药沙门氏菌具有广谱裂解活性的烈性噬菌体，建立噬菌体资源库。
系统表征候选噬菌体的生物学特性，包括宿主范围、复制动力学、环境稳定性和抗生物膜能力，评估其应用潜力。
通过全基因组测序和生物信息学分析，全面评估噬菌体的遗传安全性，排除溶原性、毒力因子和抗生素耐药基因的存在。
建立小鼠系统性沙门氏菌感染模型，比较单噬菌体和噬菌体鸡尾酒的体内治疗效果，验证其临床应用价值。
开发基于多噬菌体的协同抗菌制剂，为兽医临床和食品安全领域的沙门氏菌防控提供新型解决方案。
4. 研究思路
首先从中国西北、华中、华南和华东地区的畜禽粪便、家禽废水、屠宰场污水和医院污水等环境样本中采集样品，以肠炎沙门氏菌SE006为宿主菌，通过双层琼脂法分离纯化噬菌体。通过斑点试验和噬斑形成效率（EOP）测定宿主范围，筛选出4株裂解谱最广的烈性噬菌体。
随后开展生物学特性研究：利用透射电镜观察噬菌体形态；通过梯度MOI感染实验确定最佳感染复数；采用一步生长曲线法测定潜伏期和裂解量；在不同pH（2-12）和温度（4-60℃）条件下孵育后测定滴度，评估环境稳定性；通过Bioscreen C系统连续监测OD600值，评价不同MOI下的体外裂解活性；利用结晶紫染色和活菌计数法，检测噬菌体对生物膜形成的抑制作用和对成熟生物膜的破坏能力。
进行基因组学分析：提取噬菌体基因组DNA，采用Illumina平台测序，组装后进行功能注释，通过CARD、VFDB等数据库筛查有害基因；基于全基因组或末端酶大亚基基因构建系统发育树，确定分类地位。
最后建立BALB/c小鼠系统性感染模型，腹腔注射致死剂量的SE006后3-4小时给予噬菌体治疗，监测12天内小鼠存活率，测定24小时后器官细菌载量和噬菌体滴度，并进行组织病理学检查，综合评估体内治疗效果和安全性。
5. 研究亮点
分离得到4株分属不同病毒科（Demerecviridae、Drexlerviridae、Autographiviridae、Straboviridae）的广谱沙门氏菌噬菌体，其中DN03和DN28能裂解所有29株测试菌株，覆盖13种血清型，包括临床和食品来源的多重耐药菌株。
首次系统评估了这些噬菌体在极端环境条件下的稳定性，证实其在pH3-11和4-50℃范围内保持高活性，能够适应胃肠道酸性环境和食品加工储存条件。
全基因组测序证实4株噬菌体均为严格烈性噬菌体，不含任何溶原相关基因、毒力因子和抗生素耐药基因，从遗传层面确保了应用安全性。
体外实验显示噬菌体不仅能有效抑制浮游细菌生长，还能显著破坏成熟生物膜，鸡尾酒制剂对生物膜的抑制率和破坏率分别达到89%和90%，解决了生物膜导致的持续性感染难题。
小鼠体内实验中，噬菌体鸡尾酒实现了100%的存活率，显著优于单噬菌体治疗（25%-85%），且能快速清除器官中的细菌，减轻组织病理损伤，无明显毒副作用。
样本来源覆盖中国四大地理区域的不同生态环境，分离的噬菌体具有广泛的地域代表性，为应对不同地区的沙门氏菌流行株提供了多样化的选择。
6. 可延伸的方向
优化噬菌体鸡尾酒的配方比例和给药剂量，评估口服、喷雾、饲料添加等不同给药途径的效果，开发适合畜禽养殖和食品加工的实用剂型。
开展大规模田间试验，验证噬菌体在肉鸡、生猪等养殖环节中减少沙门氏菌定植和传播的效果，评估其对动物生长性能和肠道菌群的影响。
开发噬菌体的稳定化递送系统，如微胶囊包埋技术、可食性抗菌包装膜，提高噬菌体在饲料、食品和环境中的稳定性和缓释性能。
研究噬菌体与低剂量抗生素、益生菌、植物精油的协同抗菌作用，开发联合防控策略，进一步提高杀菌效果并降低耐药性产生风险。
评估噬菌体在食品加工环境中的应用效果，如对设备表面、冷链运输过程中沙门氏菌生物膜的清除作用，延长食品货架期。
长期监测噬菌体治疗后细菌耐药性的演变规律，研究噬菌体抗性产生的分子机制，制定针对性的防控措施。
扩展噬菌体的宿主范围，分离针对其他重要食源性致病菌（如副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7）的噬菌体，开发多病原联合防控的广谱噬菌体鸡尾酒。
7. 测量的数据及其研究意义
4株噬菌体对29株不同血清型沙门氏菌的宿主范围和裂解谱数据，数据来自图1。图1显示DN01裂解21株（72.4%）、DN19裂解27株（93.1%）、DN03和DN28裂解全部29株（100%），明确了各噬菌体的裂解能力和广谱性，为鸡尾酒配方设计提供了依据。
噬菌体的噬菌斑形态和透射电镜图像数据，数据来自图2。图2A显示所有噬菌体均形成清晰透明的噬菌斑，证实为烈性噬菌体；图2B展示了各噬菌体的头部大小和尾部结构，为其分类鉴定提供了形态学依据。
不同MOI下的噬菌体增殖滴度数据，数据来自图3A-D。图3确定了DN01和DN03的最佳MOI为0.1，DN19和DN28为0.01，且后两者在极低MOI（≤0.0001）下仍能高效增殖，为噬菌体的大规模生产和应用剂量提供了参考。
噬菌体一步生长曲线数据，数据来自图3E-H。图3测定了DN01潜伏期10分钟、裂解量80 PFU/细胞，DN03、DN19、DN28潜伏期20分钟、裂解量约60 PFU/细胞，揭示了噬菌体的复制动力学特征，反映其感染效率。
不同pH条件下的噬菌体滴度数据，数据来自图4A-D。图4显示4株噬菌体在pH3-11范围内保持稳定，pH<3或>11时滴度显著下降，证实其能耐受胃肠道的酸性环境，适合口服给药。
不同温度条件下的噬菌体滴度数据，数据来自图4E-H。图4显示噬菌体在4-50℃稳定，60℃时部分失活，为噬菌体的储存、运输和食品加工条件提供了参数依据。
不同MOI下噬菌体对沙门氏菌的体外裂解曲线数据，数据来自图5。图5展示了噬菌体感染后细菌OD600的动态变化，证实高MOI裂解更快，且鸡尾酒能有效抑制单噬菌体治疗后出现的细菌耐药性再生长。
噬菌体对生物膜形成的抑制和对成熟生物膜的破坏数据，数据来自图6。图6A-B显示10⁸ PFU/mL噬菌体处理48小时后，生物膜形成抑制率达55%-72%；图6C-D显示对成熟生物膜的破坏率达55%-72%，鸡尾酒达90%，证明其在生物膜相关感染中的应用价值。
4株噬菌体的基因组结构和功能注释数据，数据来自图7。图7展示了各噬菌体的基因组大小、GC含量和功能模块分布，证实其不含溶原、毒力和耐药基因，为遗传安全性提供了直接证据。
噬菌体的系统发育树数据，数据来自图8。图8基于全基因组序列构建系统发育树，将4株噬菌体分别归类到4个不同的病毒科，与形态学观察结果一致，明确了其进化地位。
小鼠感染后24小时器官细菌载量和噬菌体滴度数据，数据来自图9A-B。图9A显示噬菌体治疗显著降低了肝脏、脾脏、盲肠和血液中的细菌载量，鸡尾酒组几乎完全清除；图9B显示噬菌体在体内能有效复制，鸡尾酒组滴度最高，解释了其优异的治疗效果。
小鼠12天生存曲线数据，数据来自图9C。图9显示PBS组存活率0%，单噬菌体组25%-85%，鸡尾酒组100%，直观证明了鸡尾酒疗法的协同优势和卓越疗效。
小鼠盲肠组织病理切片数据，数据来自图10。图10显示PBS组盲肠组织严重损伤，噬菌体治疗组尤其是鸡尾酒组组织形态接近正常，证实噬菌体治疗能有效减轻细菌导致的病理损伤，且无明显毒副作用。
8. 结论
本研究成功分离并系统表征了4株新型烈性沙门氏菌噬菌体DN01、DN03、DN19和DN28，它们具有广谱裂解活性，能有效杀灭包括多重耐药菌株在内的多种沙门氏菌血清型。4株噬菌体表现出良好的环境稳定性，在pH3-11和4-50℃范围内保持高感染性，且能显著抑制生物膜形成并破坏成熟生物膜。全基因组分析证实其为严格烈性噬菌体，不含任何有害基因，遗传安全性高。小鼠体内实验表明，噬菌体治疗能显著降低器官细菌载量，提高感染小鼠存活率，其中由4株噬菌体组成的鸡尾酒制剂实现了100%的保护率，效果显著优于单噬菌体治疗。这些结果表明，本研究分离的噬菌体尤其是鸡尾酒制剂，是控制多重耐药肠炎沙门氏菌感染的安全、有效工具，在兽医临床、畜禽养殖和食品安全领域具有广阔的应用前景。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪测定了不同MOI下4株噬菌体及其鸡尾酒对肠炎沙门氏菌SE006的体外裂解活性，通过连续监测OD600值的变化获得了高分辨率的细菌生长动力学曲线，这些数据在本研究中具有以下关键意义：
实现高通量平行实验：Bioscreen C采用100孔蜂窝板设计，可同时测定96个样品的生长曲线。本研究需要测试4株噬菌体在5个不同MOI（0.0001-10）下的裂解效果，同时设置空白对照和噬菌体对照，总计超过50个样品。这种高通量能力使得所有实验条件能在完全相同的环境下同时进行，消除了批次间差异，提高了数据的可比性和可靠性。
提供高时间分辨率的裂解动态数据：仪器每30-60分钟自动测定一次OD600值，连续监测12小时，完整记录了噬菌体感染后细菌从对数生长到裂解死亡，再到耐药突变株再生长的全过程。这比传统的终点取样法能更准确地捕捉到裂解起始时间、裂解速率和最大裂解程度等关键参数，为评估噬菌体的裂解效率提供了量化依据。
精确量化不同MOI的剂量效应：通过比较不同MOI下的生长曲线，明确了噬菌体裂解效果与感染复数的剂量依赖关系：MOI越高，裂解起始时间越早，裂解越彻底。同时确定了最低有效MOI（0.0001），为后续体外实验和体内给药剂量的选择提供了重要参考，避免了过高或过低剂量导致的效果不佳或资源浪费。
直观展示噬菌体鸡尾酒的协同优势：Bioscreen的连续监测清晰显示，单噬菌体处理后约6-8小时会出现细菌再生长，这是由于噬菌体抗性突变株的产生；而鸡尾酒处理组能完全抑制细菌再生长长达12小时。这一结果直接证明了多噬菌体联合使用能有效克服细菌的噬菌体抗性，为鸡尾酒疗法的优越性提供了直观的实验证据。
保证实验的高重复性和标准化：仪器内置精确的恒温控制系统（37℃±0.1℃）和振荡功能，所有孔位的培养条件高度均一。自动读数避免了人工操作带来的误差，使得实验结果具有良好的重复性。这种标准化的测定方法也为不同实验室之间比较噬菌体裂解活性提供了统一的基准。
为噬菌体的筛选和评价提供快速方法：传统的噬斑计数法测定噬菌体活性需要24-48小时，而Bioscreen C能在12小时内完成裂解活性的评估，大大缩短了噬菌体筛选的周期。这对于从大量环境样本中快速筛选高效裂解性噬菌体具有重要的实用价值，提高了研究效率。