Antibacterial mechanism of a novel bovine-derived peptide F1 against colistin-resistant Escherichia coli through ClpP, ClpX and YihG
一种新型牛源肽F1通过ClpP、ClpX和YihG对抗耐粘菌素大肠杆菌的抗菌机制
来源：LWT - Food Science and Technology 223 (2025) 117726
1.摘要
质粒介导的移动粘菌素耐药（mcr）基因的出现对公共卫生和畜牧业构成重大威胁。前期研究发现抗菌肽（AMP）F1具有广谱抗菌活性，包括对携带mcr-1的大肠杆菌SHP45株，但关键作用基因仍需进一步探究。本研究结合前期蛋白质组学结果与CRISPR/Cas9编辑技术，构建clpP、clpX和yihG过表达菌株，通过抗菌活性测定、凝胶阻滞实验、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）及细胞膜和细胞壁通透性实验，阐明AMP F1的作用机制。结果表明，AMP F1通过上调YihG改变磷脂双分子层结构，通过上调ClpX失调ClpP–ClpX自溶系统，破坏细胞结构完整性；同时，AMP F1通过结合基因组DNA并增强ClpXP活性降解分裂蛋白FtsZ和ZapC，抑制细菌增殖。本研究在分子水平阐明了AMP F1的抗菌机制，为其作为对抗耐粘菌素大肠杆菌的天然制剂、提升全球生物安全和食品安全提供了理论依据。
2.关键词（中文）
抗菌肽、抗菌机制、粘菌素耐药性、大肠杆菌、ClpXP蛋白酶、YihG蛋白
3.研究目的
针对质粒介导的耐粘菌素大肠杆菌（mcr-1阳性）日益严峻的公共卫生威胁，以及前期发现的抗菌肽F1对该耐药菌的抗菌活性但分子机制不明的问题，通过CRISPR/Cas9技术精准构建clpP、clpX和yihG基因过表达菌株，结合多维度表型和分子实验，系统阐明F1对抗耐粘菌素大肠杆菌的具体作用通路，验证三个关键基因在抗菌过程中的功能，为开发新型天然抗菌剂、应对抗生素耐药性危机提供科学基础。
4.研究思路
首先基于前期iTRAQ定量蛋白质组学结果，筛选出F1处理后表达显著上调的ClpP、ClpX（自溶系统）和YihG（膜磷脂合成）三个关键蛋白；利用CRISPR/Cas9技术将T5启动子、RBS序列及目标基因插入大肠杆菌BW25113基因组的SS3安全位点，构建三个基因的过表达菌株并通过琼脂糖凝胶电泳验证；通过肉汤微量稀释法测定F1对野生型和过表达菌株的最低抑菌浓度（MIC），比较菌株敏感性差异；采用CLSM观察FITC标记的F1与细菌膜的相互作用及细胞内定位；通过SEM和TEM分别观察F1对细菌表面和内部超微结构的影响；检测细胞内Ca²⁺、总蛋白（细胞膜通透性）和碱性磷酸酶（AKP，细胞壁通透性）的泄漏情况；利用凝胶阻滞实验分析F1与细菌基因组DNA的结合能力；最后综合所有实验结果，构建F1“接触-渗透-自溶”的多靶点抗菌机制模型。
5.研究亮点
首次将蛋白质组学筛选与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，精准定位并功能验证了ClpP、ClpX和YihG在抗菌肽作用中的关键角色，突破了传统抗菌机制研究仅停留在表型层面的局限。
系统揭示了F1的多靶点协同抗菌机制：不仅通过破坏细胞膜和细胞壁发挥作用，还通过调控细胞内自溶系统降解分裂蛋白、直接结合基因组DNA干扰遗传信息传递，为理解抗菌肽的作用模式提供了新视角。
针对全球关注的mcr-1介导的粘菌素耐药问题，验证了F1对该耐药菌的有效性，且其多靶点作用特性不易诱导细菌产生耐药性，为解决“最后一道防线”抗生素失效问题提供了新的天然候选药物。
构建的基因过表达菌株模型具有良好的通用性，可用于后续其他抗菌肽或天然产物的作用机制研究，为抗菌药物研发提供了标准化的实验工具。
6.可延伸的研究方向
利用分子动力学模拟、等温滴定量热法（ITC）和定点突变技术，明确F1与ClpP、ClpX、YihG蛋白的直接结合位点和相互作用模式，解析其分子识别机制。
对F1进行结构优化，通过氨基酸替换、环化修饰等手段提高其抗菌活性、蛋白酶稳定性和体内生物利用度，降低工业化生产成本。
开展小鼠感染模型实验，评价F1在体内的抗菌效果、药代动力学特征和安全性，为临床前研究奠定基础。
研究F1与粘菌素、碳青霉烯类等传统抗生素的协同抗菌作用，优化联合用药方案，减少抗生素用量，延缓耐药性的产生和传播。
评估F1对其他多重耐药菌（如耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌）的抗菌活性，拓展其应用范围。
探索F1在食品保鲜领域的应用，开发针对即食食品、肉制品的天然防腐剂，保障食品安全。
7.测量的数据及其研究意义
过表达菌株构建验证数据：来自图2（琼脂糖凝胶电泳图），显示野生型菌株（1470 bp）和clpP（2149 bp）、yihG（2458 bp）、clpX（2800 bp）过表达菌株的PCR产物条带大小。研究意义：确证三个目标基因成功整合到大肠杆菌基因组的SS3位点，且无明显生长缺陷，为后续实验提供了可靠的遗传材料。
细菌生长曲线与MIC数据：来自图3（A-E），包括不同浓度F1处理下四种菌株的OD600生长曲线，以及1×MIC浓度下四种菌株的OD600比较。研究意义：确定F1对四种菌株的MIC均为1.2 mg/mL，发现clpX过表达菌株对F1最敏感，clpP过表达菌株敏感性最低，初步证实ClpX是F1抗菌过程中的核心调控因子。
共聚焦激光扫描显微镜图像数据：来自图4（A-L），显示0、45、90 min时FITC-F1（绿色）与FM4-64标记的细胞膜（红色）的共定位情况。研究意义：直观证明F1首先吸附于细菌细胞膜，随后穿透进入细胞质，且yihG过表达菌株中F1的渗透速度显著加快，明确YihG在F1膜渗透阶段的促进作用。
扫描电子显微镜图像数据：来自图5（A-L），显示0、45、90 min时F1处理后细菌的表面形态变化。研究意义：观察到F1导致细菌表面粗糙、凹陷、穿孔和破碎，clpX和yihG过表达菌株的结构破坏更严重，从细胞表面水平验证了F1对细菌结构的损伤作用。
透射电子显微镜图像数据：来自图6（A-L），显示0、45、90 min时F1处理后细菌的内部超微结构变化。研究意义：观察到F1引起细胞质收缩、空泡化、质壁分离和核区降解，clpX和yihG过表达菌株的内部结构破坏更显著，从细胞内部水平揭示了F1的杀菌机制。
细胞膜通透性数据：来自图7（A-B），包括不同时间点上清液中Ca²⁺和总蛋白的浓度。研究意义：量化了F1对细胞膜的破坏程度，证实细胞膜通透性随处理时间延长而升高，且clpX和yihG过表达菌株的物质泄漏更严重，与电镜结果相互印证。
细胞壁通透性数据：来自图8，显示不同时间点上清液中碱性磷酸酶（AKP）的活性。研究意义：量化了F1对细胞壁的破坏程度，发现180 min时clpX过表达菌株的AKP活性显著高于其他菌株，证实ClpX介导的自溶系统失调是细胞壁破坏的主要原因。
凝胶阻滞实验数据：来自图9，显示不同浓度F1处理后细菌基因组DNA的电泳条带变化。研究意义：首次证实F1能直接结合大肠杆菌基因组DNA，且结合能力呈浓度依赖性，在2.4 mg/mL时可完全阻滞DNA迁移，揭示了F1通过干扰遗传物质功能抑制细菌增殖的新途径。
抗菌机制示意图：来自图10，总结了F1的多靶点作用通路。研究意义：清晰呈现了F1从膜吸附、渗透到细胞内自溶和DNA破坏的完整抗菌过程，为理解其分子机制提供了直观的框架。
8.结论
本研究成功构建了clpP、clpX和yihG基因过表达大肠杆菌菌株，系统阐明了抗菌肽F1对抗耐粘菌素大肠杆菌的“接触-渗透-自溶”多靶点抗菌机制。F1首先通过静电吸附结合细菌细胞膜，上调YihG表达改变磷脂双分子层的组成和流动性，加速自身渗透进入细胞质；在细胞内，F1特异性上调ClpX表达，导致ClpP-ClpX自溶系统失调，增强的ClpXP蛋白酶活性不仅降解细胞分裂关键蛋白FtsZ和ZapC，阻断细菌分裂周期，还破坏细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞内容物大量泄漏；此外，F1还能直接结合细菌基因组DNA，干扰RNA转录和蛋白质合成过程，最终导致细菌死亡。其中，ClpX是F1抗菌作用中最关键的调控因子，YihG主要促进膜渗透，而ClpP的作用相对较弱。本研究在分子水平明确了F1的抗菌机制，为其开发成为对抗耐粘菌素大肠杆菌的新型天然抗菌剂提供了坚实的理论支撑，对应对全球抗生素耐药性危机、保障公共卫生和食品安全具有重要意义。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析系统，在最低抑菌浓度（MIC）测定实验中，通过实时监测600 nm处的光密度（OD600）值，绘制不同浓度F1处理下大肠杆菌的生长曲线，以此确定F1的MIC值。其研究意义主要体现在以下方面：
高通量与自动化：该仪器支持100孔微量板同时检测，可并行分析野生型和三个过表达菌株在7个F1浓度梯度下的生长情况，大幅提高了实验效率，减少了传统平板计数法的繁琐操作和人为误差。
动态连续监测：每隔固定时间自动读取OD值，能够完整记录细菌生长的延迟期、对数期、稳定期和衰亡期，准确捕捉F1对细菌生长的抑制动态，避免了终点法仅能获取单一时间点数据的局限性，可更精准地判断细菌是否被完全抑制。
高灵敏度与准确性：仪器的光学检测系统具有高灵敏度，能够准确测量低浓度细菌的OD值，确保了MIC值测定的准确性和重复性。本研究通过该方法确定F1对四种菌株的MIC均为1.2 mg/mL，为后续所有抗菌机制实验的浓度设定提供了可靠依据。
标准化实验条件：仪器内置恒温培养和振荡功能，保证所有样品在相同的温度（37℃）、通气和搅拌条件下生长，消除了环境因素对实验结果的影响，提高了不同菌株、不同浓度组之间数据的可比性。
数据可视化与快速分析：配套软件可自动生成生长曲线，直观展示不同处理组的细菌生长差异，便于快速比较菌株对F1的敏感性。本研究中通过生长曲线发现clpX过表达菌株在1×MIC浓度下的OD值显著低于其他菌株，为后续聚焦ClpX的机制研究指明了方向。
需要注意的是，Bioscreen C仪器基于光散射原理测量细菌浓度，适用于澄清的液体培养基体系。本研究中使用的LB肉汤符合该要求，因此获得了准确可靠的生长曲线数据；若培养基本身含有浑浊成分（如牛炖汤肉汤），则需采用平板计数法进行验证。