Reduction of viability, heat resistance, and biofilm formation and persistence of Bacillus cereus spores in beef stew broth by herb and spice extracts
通过草本和香料提取物降低牛炖汤中蜡状芽胞杆菌孢子的存活能力、耐热性和生物膜形成与持久性
来源：Food Research International 221 (2025) 117606
1.摘要
本研究探究了16种植物（8种草本、8种香料）的乙醇提取物对牛炖汤中两种产毒型蜡状芽胞杆菌（腹泻型CH3株、呕吐型JCM 17690株）孢子的存活能力、耐热性、生物膜形成及持久性的抑制作用。基于体外和原位最低抑菌浓度（MIC）筛选出效果最优的提取物：草本类为迷迭香和鼠尾草（MIC均为0.3125 mg/mL），香料类为肉豆蔻衣和姜黄（MIC均为0.625 mg/mL），且所有粉末状提取物的MIC均等于或低于干燥状提取物。四种粉末状提取物均显著降低孢子存活率（草本类降低50.46%-90.91%，香料类降低52.36%-86.01%）和耐热性（草本类降低16.64%-48.63%，香料类降低9.69%-45.41%）；完全抑制蜡状芽胞杆菌孢子的生物膜形成，并有效破坏已形成的生物膜（草本类降低12.16%-77.83%，香料类降低14.13%-70.99%），同时显著降低生物膜内孢子的耐热性（草本类降低9.45%-35.67%，香料类降低8.90%-28.27%）。上述抑制作用呈浓度依赖性，且抑制强度具有菌株特异性。研究表明，天然植物提取物与传统热处理结合，有望成为控制牛炖汤及其他即食肉制品中蜡状芽胞杆菌污染的有效策略。
2.关键词（中文）
食物中毒、呕吐型、腹泻型、即食肉制品、胞外聚合物、D值、食源性暴发
3.研究目的
针对蜡状芽胞杆菌通过孢子形成和生物膜产生的双重耐药机制，以及其在高蛋白食品基质（如牛炖汤）中污染风险高但防控研究不足的问题，筛选对腹泻型和呕吐型蜡状芽胞杆菌孢子具有高效抑制作用的草本和香料提取物，评估其在牛炖汤体系中对孢子存活、耐热性、生物膜形成及持久性的抑制效果，并验证提取物处理后牛炖汤的感官可接受性，为开发即食肉制品中蜡状芽胞杆菌的天然防控策略提供科学依据。
4.研究思路
首先选取16种常见草本和香料，分别制备干燥状和粉末状的乙醇提取物；以腹泻型蜡状芽胞杆菌CH3株和呕吐型JCM 17690株为研究对象，通过肉汤稀释法测定体外（BHI肉汤）和原位（牛炖汤肉汤）的最低抑菌浓度（MIC），筛选出抑菌效果最优的4种提取物（迷迭香、鼠尾草、肉豆蔻衣、姜黄）。随后在牛炖汤体系中，评估这4种提取物对浮游孢子存活能力和100℃下耐热性（D₁₀₀℃值）的影响；以不锈钢试片为载体，测定提取物对孢子源生物膜形成能力、已形成生物膜持久性（通过胞外聚合物EPS含量表征）以及生物膜内孢子耐热性的抑制作用。最后通过感官评价实验，评估添加不同浓度提取物的牛炖汤的感官特性和消费者接受度，综合确定兼具抑菌效果和感官适宜性的天然防控方案。
5.研究亮点
首次系统比较了16种草本和香料的干燥状与粉末状提取物对两种产毒型蜡状芽胞杆菌的抑菌效果，明确了粉末状提取物因比表面积更大，活性成分释放更充分，抑菌效果更优。
突破了以往仅关注营养体细胞或浮游孢子的研究局限，全面评估了提取物对蜡状芽胞杆菌孢子存活、浮游孢子耐热性、生物膜形成、成熟生物膜持久性及生物膜内孢子耐热性的多重抑制作用，覆盖了该病原菌在食品中的主要存活和耐药形态。
在真实食品基质（牛炖汤肉汤）中开展原位验证，而非仅依赖体外实验，同时结合感官评价，兼顾了防控效果与食品的食用品质，研究结果更具实际应用价值。
揭示了提取物抑制作用的菌株特异性，发现草本提取物对腹泻型菌株效果更优，香料提取物对呕吐型菌株效果更优，为针对性防控不同产毒型蜡状芽胞杆菌提供了依据。
6.可延伸的研究方向
深入探究迷迭香、鼠尾草、肉豆蔻衣和姜黄中主要活性成分（如迷迭香酸、鼠尾草酚、肉豆蔻木脂素、姜黄素）单独及协同作用的抑菌机制，通过靶向结构和生理实验明确其对孢子结构、生物膜形成信号通路的作用靶点。
验证这些提取物在其他高蛋白即食食品基质（如肉汤、肉制品罐头、预制菜）中的抑菌效果，优化不同食品体系中的提取物添加浓度和使用方式。
开展提取物与温和热处理、高压处理、辐照等其他食品加工技术的协同杀菌研究，进一步降低热处理强度，最大程度保留食品的营养和感官品质。
进行中试和工业化生产规模的验证实验，评估提取物在实际生产、储存和流通过程中的稳定性和抑菌持久性。
研究提取物对蜡状芽胞杆菌产毒能力的影响，明确其是否能抑制毒素的合成与释放，进一步提升食品安全性。
7.测量的数据及其研究意义
最低抑菌浓度（MIC）数据：来自表1，包括16种草本和香料提取物在BHI肉汤和牛炖汤肉汤中对两种蜡状芽胞杆菌菌株的MIC值。研究意义：筛选出抑菌效果最优的4种提取物，明确了提取物形态（粉末状优于干燥状）和食品基质对抑菌效果的影响，为后续实验的提取物选择和浓度设定提供了基础。
浮游孢子存活率数据：来自图1和图S1，为不同浓度提取物处理后两种菌株浮游孢子的相对菌落数。研究意义：量化了提取物对蜡状芽胞杆菌孢子的直接杀灭效果，证实了其浓度依赖性和菌株特异性，明确了迷迭香对腹泻型菌株、姜黄对呕吐型菌株的最优杀孢子效果。
浮游孢子相对D₁₀₀℃值数据：来自图2和图S2，为不同浓度提取物处理后两种菌株浮游孢子的相对D₁₀₀℃值及实际D₁₀₀℃值。研究意义：证明了提取物能显著降低蜡状芽胞杆菌孢子的耐热性，为实现温和热处理杀菌提供了理论依据，同时揭示了香料提取物对呕吐型菌株耐热性的更强抑制作用。
生物膜相对EPS含量数据：来自图3和图S3，为不同浓度提取物处理后两种菌株形成的生物膜的相对EPS总含量（碳水化合物+蛋白质）。研究意义：表征了提取物对生物膜形成和持久性的抑制效果，证实所有提取物在10 mg/mL浓度下即可完全抑制生物膜形成，80 mg/mL浓度下可完全降解成熟生物膜，为解决食品接触表面的生物膜污染问题提供了数据支持。
生物膜内孢子相对D₁₀₀℃值数据：来自图4和图S4，为不同浓度提取物处理后两种菌株生物膜内孢子的相对D₁₀₀℃值及实际D₁₀₀℃值。研究意义：首次明确了提取物能有效降低生物膜内孢子的耐热性，揭示了生物膜分散和孢子结构破坏的双重作用机制，填补了生物膜内孢子耐热性防控研究的空白。
感官评价数据：来自图5和表2，包括添加不同浓度提取物的牛炖汤在颜色、香气、质地、口感、整体接受度方面的评分及最终偏好排名。研究意义：验证了姜黄提取物在有效抑菌浓度下对牛炖汤的感官品质影响最小，消费者接受度与对照组无显著差异，为提取物的实际应用提供了感官可行性依据。
8.结论
本研究证实迷迭香、鼠尾草、肉豆蔻衣和姜黄的粉末状乙醇提取物对牛炖汤中腹泻型和呕吐型蜡状芽胞杆菌孢子具有多重抑制作用，且效果呈浓度依赖性和菌株特异性。其中，迷迭香对腹泻型CH3株孢子的存活、生物膜持久性及生物膜内孢子耐热性的抑制效果最优，姜黄对呕吐型JCM 17690株的上述指标抑制效果最优；所有提取物均能完全抑制孢子的生物膜形成，并在高浓度下完全降解成熟生物膜。提取物的抑菌活性主要源于其含有的多酚类化合物，可通过破坏孢子膜结构、干扰群体感应、 destabilize胞外聚合物等方式发挥作用。将这些天然提取物与传统热处理结合，可降低热处理强度，减少食品营养和感官品质的损失。感官评价结果显示，20-40 mg/mL浓度的姜黄提取物对牛炖汤的感官接受度无显著影响，兼具抑菌效果和食用品质，是防控即食肉制品中蜡状芽胞杆菌污染的理想天然抗菌剂。后续需进一步明确提取物的作用机制，并开展不同食品基质和工业化规模的验证研究。
9.芬兰Bioscreen C仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析系统，在体外MIC测定实验中，通过每2小时测定600 nm处的光密度值，实时监测BHI肉汤中蜡状芽胞杆菌的生长情况，以此确定提取物的最低抑菌浓度。其研究意义主要体现在以下方面：
实现了微生物生长的高通量、自动化连续监测，可同时测定多个提取物浓度和菌株的生长曲线，大幅提高了实验效率和数据的准确性，避免了传统平板计数法的繁琐操作和人为误差。
通过动态监测光密度变化，能够精准捕捉细菌生长的延迟期、对数期和稳定期，从而准确判断提取物是否完全抑制细菌生长，确保MIC值测定的可靠性。
该仪器的微量反应体系（每孔200 μL）大幅减少了试剂和样品的用量，降低了实验成本，同时保证了实验条件的均一性。
在体外实验中获得的生长曲线数据，为后续原位实验中提取物浓度的设定提供了重要参考，也为比较不同提取物的抑菌活性强弱提供了量化依据。
需要注意的是，由于牛炖汤肉汤本身具有颜色，无法通过光密度法进行生长监测，因此原位MIC测定采用了传统的平板计数法，这也体现了Bioscreen C仪器在澄清培养基体系中微生物生长监测的独特优势。