全自动生长曲线分析仪

Development of extensive growth and growth boundary models for mesophilic and psychrotolerant Bacillus cereus in dairy products (Part 1)

乳制品中嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌的广泛生长及生长边界模型开发（第一部分）

来源：Front. Microbiol. 16:1553885.

1. 摘要

目前缺乏防止蜡样芽孢杆菌在食品中发生不可接受生长的产品特性组合指南，因此预测模型对于评估其生长响应具有重要价值。本研究使用乳制品来源的蜡样芽孢杆菌分离株生成了全面数据集，分别为嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌开发了两个基数参数生长和生长边界模型，每个模型均纳入了温度、pH、NaCl/水分活度、5种有机酸（乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、山梨酸）、3种磷酸盐（正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐）共11种环境因素的抑制作用及其相互影响。在标准实验室培养基BHI肉汤中分别获得了231个和203个嗜温性和耐冷性菌株鸡尾酒的最大比生长速率（μmax）值，并在乳制品特异性培养基乳清超滤渗透液（UF渗透液）中额外获得了113个和100个μmax值以评估生长响应差异。研究发现，两类菌株在UF渗透液中均表现出比BHI肉汤更强的酸耐受性，具有更低的最低生长pH和更高的乳酸、柠檬酸最低抑菌浓度（MIC）。采用保守方法选择BHI肉汤或UF渗透液中获得的基数参数值，以确保每个环境因素都能得到最宽的生长范围。这两个新模型能够预测储存温度和多种乳制品特性（包括有机酸和磷酸盐熔融盐的组合）的综合影响，可支持对各类乳制品中两类蜡样芽孢杆菌的评估和管理，但模型的性能和适用范围仍需通过产品验证来确定。

2. 关键词

预测建模、基数参数、有机酸、磷酸盐、生长边界、食品安全

3. 研究目的

开发两个广泛适用的预测模型，分别用于预测嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌在各类乳制品环境条件下的生长速率和生长边界。

系统量化11种与乳制品密切相关的环境因素（温度、pH、水分活度、5种有机酸、3种磷酸盐）对两类蜡样芽孢杆菌生长的抑制作用，确定其基数参数值。

比较实验室培养基（BHI肉汤）和乳制品模拟基质（UF渗透液）中蜡样芽孢杆菌的生长响应差异，评估培养基对基数参数估计的影响。

采用保守的参数选择方法构建包含因素间相互作用的二级模型，确保模型预测的安全性和适用性，为乳制品企业的产品开发和食品安全管理提供工具。

4. 研究思路

首先筛选出6株嗜温性（panC III组）和7株耐冷性（panC II、III、VI、VIII组）乳制品来源的蜡样芽孢杆菌，分别组成菌株鸡尾酒，确保模型具有代表性。然后使用芬兰Bioscreen C自动生长曲线分析仪，在BHI肉汤和1.45% UF渗透液两种培养基中，测定不同环境因素水平下的细菌生长曲线，通过检测时间法计算最大比生长速率（μmax）。

针对每个环境因素，使用相应的基数模型方程拟合μmax数据，估计其基数参数值：温度使用gamma概念模型，pH使用Rosso模型，水分活度使用线性模型，乙酸、苯甲酸、山梨酸使用Presser模型，乳酸和柠檬酸使用修正的双参数模型，磷酸盐使用线性模型。采用保守方法，对于pH、乳酸和柠檬酸，选择UF渗透液中得到的更宽生长范围参数；对于温度、水分活度、其他有机酸和磷酸盐，使用BHI肉汤中的参数。

最后构建包含所有11种因素及其相互作用的二级模型，使用Le Marc方法量化因素间的相互作用效应，特别是接近生长边界时的额外抑制作用。通过拟合优度检验评估模型性能，并以加工奶酪为例展示模型在复杂乳制品中的应用。

5. 研究亮点

首次开发了纳入11种环境因素的蜡样芽孢杆菌生长和生长边界模型，首次将苯甲酸、山梨酸和三种磷酸盐熔融盐纳入模型，显著扩展了现有模型的适用范围，可覆盖奶酪、乳制品甜点、加工奶酪等多种乳制品。

同时使用实验室培养基和乳制品模拟基质（UF渗透液）测定基数参数，首次发现蜡样芽孢杆菌在UF渗透液中对低pH和高浓度柠檬酸、乳酸的耐受性显著高于BHI肉汤，揭示了乳制品基质对细菌胁迫耐受性的增强作用。

采用保守的参数选择策略，选择两种培养基中得到的最宽生长范围参数，确保模型预测的安全性，避免了因低估细菌生长能力而导致的食品安全风险。

分别为嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌建立了独立模型，明确了两类菌株在温度适应性、酸耐受性和磷酸盐敏感性等方面的差异，提高了预测的精准性。

模型纳入了环境因素间的相互作用，使用Le Marc方法量化其效应，解决了传统乘法模型在接近生长边界时预测不准确的问题。

6. 可延伸的方向

开展广泛的乳制品产品验证研究，包括牛奶、发酵乳、农家奶酪、奶油奶酪、加工奶酪、乳制品甜点等不同类型产品，确定模型的适用范围和需要校准的参数（如μopt、滞后时间）。

将蜡样芽孢杆菌孢子的萌发和生长动力学纳入模型，因为实际乳制品中主要存在的是芽孢而非营养细胞，孢子的萌发滞后时间对货架期预测至关重要。

评估模型在动态储存条件下的预测性能，如温度波动、不同包装气氛（真空、气调）和光照等因素的影响。

开发用户友好的软件工具或在线平台，使食品企业能够方便地输入产品特性和储存条件，快速获得蜡样芽孢杆菌的生长预测结果，支持产品配方设计和货架期评估。

研究乳制品中其他成分（如乳脂肪、乳蛋白水解产物、益生菌代谢产物、天然防腐剂）对蜡样芽孢杆菌生长的影响，进一步完善模型的因素覆盖范围。

将生长模型与定量微生物风险评估（QMRA）相结合，量化不同乳制品中蜡样芽孢杆菌的暴露水平和健康风险，为制定食品安全标准提供科学依据。

扩展模型的适用范围，评估其在其他食品类别（如肉制品、谷物制品、即食食品）中的预测性能。

7. 测量的数据及其研究意义

温度对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图1A（嗜温性）和图1B（耐冷性）。图1展示了13-45℃（嗜温性）和8-40℃（耐冷性）范围内的生长速率变化及拟合曲线，用于估计温度基数参数（Tmin、Topt、Tmax），是模型中最核心的参数之一，决定了不同储存温度下的生长潜力。

pH对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图1C（嗜温性）和图1D（耐冷性）。图1对比了BHI肉汤和UF渗透液中的pH生长响应，发现UF渗透液中pHmin更低（嗜温性4.75 vs 4.98，耐冷性4.59 vs 5.08），最终选择UF渗透液的pH参数纳入模型，确保了酸性乳制品中预测的准确性。

水分活度（aw）对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图1E（嗜温性）和图1F（耐冷性）。图1展示了不同NaCl浓度对应的aw下的生长速率，估计得到awmin分别为0.955（嗜温性）和0.963（耐冷性），对应6.1-7.2%的NaCl浓度，为高盐乳制品的配方设计提供了依据。

未解离乙酸对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图2A（嗜温性）和图2B（耐冷性）。图2展示了不同未解离乙酸浓度下的生长抑制，估计得到MIC值分别为15.6 mM（嗜温性）和5.66 mM（耐冷性），表明嗜温性菌株对乙酸的耐受性更强。

未解离苯甲酸对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图2C（嗜温性）和图2D（耐冷性）。图2展示了苯甲酸的强抑制作用，MIC值分别为0.36 mM（嗜温性）和0.13 mM（耐冷性），是本研究中抑制作用最强的有机酸。

总柠檬酸对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图2E（嗜温性）和图2F（耐冷性）。图2显示UF渗透液中柠檬酸的MIC显著高于BHI肉汤（嗜温性169.1 vs 82.5 mM，耐冷性190 vs 139 mM），首次证实了乳制品基质对柠檬酸抑制作用的减弱效应。

未解离乳酸对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图3A（嗜温性）和图3B（耐冷性）。图3展示了乳酸的抑制作用，UF渗透液中MIC值略高于BHI肉汤（嗜温性2.98 vs 2.34 mM，耐冷性2.98 vs 2.56 mM），乳酸是发酵乳制品中最主要的天然抑菌剂。

未解离山梨酸对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图3C（嗜温性）和图3D（耐冷性）。图3展示了山梨酸的抑制作用，MIC值分别为1.49 mM（嗜温性）和0.73 mM（耐冷性），常用于酸性乳制品的防腐。

正磷酸盐（P1）对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图4A（嗜温性）和图4B（耐冷性）。图4展示了正磷酸盐的抑制作用，MIC值分别为4.96%和4.88%，是三种磷酸盐中抑制作用最弱的。

焦磷酸盐（P2）对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图4C（嗜温性）和图4D（耐冷性）。图4展示了焦磷酸盐的抑制作用，MIC值分别为2.36%和2.21%，常用于加工奶酪的乳化。

三聚磷酸盐（P3）对两类菌株平方根转化μmax的影响数据，数据来自图4E（嗜温性）和图4F（耐冷性）。图4展示了三聚磷酸盐的抑制作用，MIC值分别为2.32%和2.12%，与焦磷酸盐抑制效果相近。

嗜温性蜡样芽孢杆菌在BHI和UF渗透液中的基数参数拟合值及标准误，数据来自表1。表1详细列出了所有11种因素的参数值，明确了最终纳入模型的参数选择依据，为模型的应用和修改提供了基础数据。

耐冷性蜡样芽孢杆菌在BHI和UF渗透液中的基数参数拟合值及标准误，数据来自表2。表2同样列出了耐冷性菌株的所有参数值，包括校准后的μopt（2.67 h⁻¹），用于乳制品中的生长速率预测。

乙酸和柠檬酸浓度对嗜温性蜡样芽孢杆菌预测生长边界的影响数据，数据来自图5。图5以加工奶酪为例，展示了因素间相互作用对生长边界的显著影响，说明单一因素的MIC值不能直接用于复杂产品的配方设计，必须考虑多因素的综合效应。

8. 结论

本研究成功开发了两个广泛适用的预测模型，分别用于嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌的生长和生长边界预测，模型纳入了11种与乳制品密切相关的环境因素及其相互作用。研究证实，生长培养基对环境因素抑制作用的量化具有显著影响：肉类来源的BHI肉汤适用于测定温度、水分活度、乙酸、苯甲酸、山梨酸和磷酸盐的基数参数，而乳制品来源的UF渗透液能更真实地反映蜡样芽孢杆菌在乳制品中对pH、乳酸和柠檬酸的生长边界。采用保守方法选择两种培养基中得到的最宽生长范围参数，确保了模型预测的安全性，避免了危险的低估。这两个模型能够支持乳制品企业进行产品配方优化、货架期评估和食品安全管理，帮助识别能够防止蜡样芽孢杆菌生长的产品特性组合。后续研究需要通过广泛的乳制品产品验证来确定模型的性能和适用范围，并将孢子萌发和滞后时间纳入模型以进一步提高其实用性。

9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义

本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪测定了总计647个最大比生长速率（μmax）值，这些数据是构建两个预测模型的核心基础，其研究意义体现在以下几个方面：

实现高通量多因素实验：Bioscreen C采用100孔蜂窝板设计，可同时测定96个样品的生长曲线。本研究需要测定11种环境因素的多个水平组合，每个条件设置3-5次重复，总计超过2000个培养样品。这种高通量能力将传统试管法需要数月的工作量压缩至数周完成，使得同时研究11种因素的复杂实验设计成为可能。

提供高时间分辨率的生长动力学数据：仪器每小时自动测定一次540nm的吸光度值，连续监测长达25天，获得了完整的细菌生长曲线。通过检测时间法（detection time method）计算μmax，比传统的终点法更准确，能够捕捉到接近生长边界时的低生长速率变化，确保了基数参数估计的精确性，特别是对于最低生长pH、最低水分活度和最高有机酸浓度等临界参数的测定至关重要。

保证实验条件的高度均一性：仪器内置精确的恒温控制系统，温度控制精度为±0.1℃，所有孔位的温度差异小于0.5℃；同时统一控制振荡频率和测量时间，所有样品在完全相同的条件下培养和检测。这消除了人工操作带来的系统误差，使得不同因素、不同水平之间的生长数据具有高度可比性，提高了模型参数估计的可靠性。

适用于低浊度乳制品基质：本研究使用的1.45% UF渗透液浊度极低，传统的分光光度计法难以准确测量低浓度细菌的生长。Bioscreen C具有高灵敏度的吸光度检测能力，能够准确测量OD值低至0.05的变化，确保了在UF渗透液中生长数据的准确性，为比较两种培养基的生长响应差异提供了可靠基础。

实现数据处理的标准化和自动化：研究团队开发了专门的Python脚本（https://github.com/maktabdar/bioscreen）用于处理Bioscreen输出的原始数据，自动计算每个样品的μmax值。这种标准化的数据处理流程避免了人工计算的误差，提高了结果的可重复性，也为其他研究者提供了可借鉴的数据分析方法。

支持长期低温培养实验：耐冷性蜡样芽孢杆菌在8℃下的生长周期长达25天，Bioscreen C能够进行长时间的连续监测而无需人工干预，确保了低温条件下生长数据的完整性。这对于准确估计耐冷性菌株的最低生长温度和低温生长速率至关重要，而这些参数是冷藏乳制品货架期预测的关键。

为模型验证提供了高质量的基础数据：Bioscreen测定的大量μmax数据具有良好的重复性和准确性，使得模型拟合的决定系数（R²）普遍高于0.95，确保了模型的预测性能。高质量的基础数据是构建可靠预测模型的前提，本研究中Bioscreen的应用为模型的成功开发奠定了坚实基础。