Mechanisms of acid resistance and changes in virulence factors of Escherichia coli isolated from powdered infant formula processing environment based on transcriptome and proteome analysis
基于转录组和蛋白质组分析的婴儿配方奶粉加工环境中分离的大肠杆菌的耐酸性机制及毒力因子变化
来源：L.H. Wang et al. / Food Science and Human Wellness 16 (2027)
1. 摘要
大肠杆菌是婴儿配方奶粉（PIF）加工环境中需重点监测的致病菌，其耐酸性可能削弱清洁消毒效果，导致污染率升高。本研究从中国黑龙江省8家PIF工厂的1130份样品中分离得到56株大肠杆菌，经多位点序列分型（MLST）分为19个序列型（ST）。筛选出耐酸性最强的EC56菌株（ST442）进行转录组和蛋白质组联合分析，结果表明该菌株主要通过谷氨酸依赖型（Gad）和鸟氨酸依赖型（Orn）酸耐受系统增强耐酸性；同时，酸休克蛋白（asr基因编码）和饥饿期DNA保护蛋白（dps基因编码）的表达显著上调，分别通过防止细胞失活和保护DNA免受酸诱导断裂发挥作用；外膜蛋白F（ompF基因）和色氨酸酶（tnaA基因）的下调也有助于提升细菌耐酸性。值得注意的是，酸胁迫后大肠杆菌大多数毒力因子尤其是运动功能相关因子的表达水平显著下调。本研究揭示了PIF加工环境中大肠杆菌的酸胁迫分子调控机制及毒力因子变化规律，为生产企业开展危害防控和预测细菌致病性变化提供了科学依据。
2. 关键词
大肠杆菌、加工环境、耐酸性、毒力因子、多组学分析
3. 研究目的
系统调查婴儿配方奶粉加工环境中大肠杆菌的污染分布特征和分子分型多样性；评估不同菌株的耐酸性差异，筛选出耐酸性最强的代表性菌株；采用转录组和蛋白质组联合分析策略，全面解析大肠杆菌适应酸胁迫的分子调控网络；明确酸胁迫对大肠杆菌毒力因子表达的影响，评估其潜在致病性变化；为PIF加工企业制定针对性的清洁消毒方案和食品安全风险防控措施提供理论基础和数据支持。
4. 研究思路
首先从8家PIF工厂采集涵盖原料、环境、人员等不同类型的1130份样品，通过MacConkey琼脂和伊红美蓝琼脂分离疑似菌株，经MALDI-TOF MS和16S rRNA测序鉴定为大肠杆菌；利用MLST技术对56株分离株进行分子分型，分析其遗传多样性和优势克隆群。然后设置pH2.0、3.0、4.0、5.0四个梯度，采用芬兰Bioscreen自动生长曲线分析仪测定所有菌株的生长曲线，评估其耐酸性并筛选出耐酸性最强的EC56菌株。接着分别在正常pH（7.0）和酸胁迫（4.0）条件下培养EC56至对数末期，提取总RNA和总蛋白进行转录组和蛋白质组测序；通过生物信息学分析筛选差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs），进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。通过关联分析整合转录组和蛋白质组数据，鉴定出表达趋势一致的关键耐酸性相关和毒力相关基因/蛋白。最后采用qRT-PCR技术对10个关键基因的表达水平进行验证，确保组学结果的可靠性。
5. 研究亮点
首次系统开展了中国东北地区婴儿配方奶粉加工环境中大肠杆菌的污染调查和分子分型研究，明确了原料乳、设备表面和地漏为主要污染位点，ST10为优势流行克隆，填补了该区域相关数据空白。
采用转录组与蛋白质组联合分析的多组学策略，从基因转录和蛋白表达两个层面全面揭示了大肠杆菌的耐酸性分子机制，发现Gad和Orn系统是其适应酸胁迫的核心途径，同时明确了酸休克蛋白、DNA保护蛋白和膜蛋白调控的重要作用。
同步分析了酸胁迫下大肠杆菌毒力因子的表达变化，发现"多数毒力因子下调但少数关键因子上调"的复杂现象，尤其是运动相关毒力因子普遍显著下调，而抗生素抗性、生物膜形成和黏附相关因子有所上调，为全面评估酸胁迫后大肠杆菌的致病性风险提供了新视角。
筛选出的耐酸性菌株EC56（ST442）为后续深入研究食品加工环境中大肠杆菌的胁迫适应性进化和致病机制提供了重要的实验材料。
6. 可延伸的方向
开展体内动物感染实验，验证酸胁迫处理后大肠杆菌的体内定植能力、器官侵袭性和致死率变化，补充体外毒力实验的局限性。
研究不同类型酸性消毒剂（如乳酸、柠檬酸、过氧乙酸）对大肠杆菌的作用机制差异，优化PIF加工环境的清洁消毒方案。
分析长期低剂量酸胁迫下大肠杆菌的适应性进化规律，评估其产生稳定耐酸性和毒力增强的潜在风险。
结合代谢组学技术，进一步完善酸胁迫下大肠杆菌的代谢调控网络，鉴定关键代谢标志物。
开发基于asr、gadA、gadB等关键耐酸性基因的快速检测方法，用于PIF加工环境中耐酸性大肠杆菌的实时监测。
研究温度、干燥、紫外线等其他加工环境胁迫因素与酸胁迫的协同作用，模拟更真实的食品加工场景。
调查不同地区、不同类型乳制品加工环境中大肠杆菌的耐酸性特征，比较其地域和行业差异。
7. 测量的数据及其研究意义
56株大肠杆菌的分离鉴定和MLST分型数据，数据来自表S2和表S3。表S2展示了不同样品来源的菌株分布情况，明确了原料乳、设备表面和地漏是大肠杆菌的主要污染位点，提示需加强原料质量控制和生产环境清洁；表S3列出了19种ST型，其中ST10占比最高（33.93%）且分布于5家工厂，揭示了加工环境中大肠杆菌的遗传多样性和优势克隆群，为污染源溯源提供了分子标记。
56株大肠杆菌在pH4.0 LB培养基中的生长曲线数据，数据来自图1A。该数据直观展示了不同菌株在酸胁迫下的生长差异，成功筛选出耐酸性最强的EC56菌株作为后续机制研究的对象，同时发现所有菌株在pH≤3.0时均无法生长，为确定酸胁迫实验条件提供了依据。
EC56菌株在pH7.0和pH4.0条件下的生长曲线数据，数据来自图1B。清晰呈现了酸胁迫对EC56生长动力学的影响：pH7.0时约8小时进入对数末期，pH4.0时延迟期缩短但整体生长速率降低，约24小时才达到对数末期，为转录组和蛋白质组测序的取样时间点（对数末期）提供了科学依据。
转录组测序的样本相关性热图和差异表达基因火山图，数据来自图2A和图2B。图2A显示组内生物学重复的Pearson相关系数接近1.0，证明实验重复性好；图2B鉴定出1412个差异表达基因（511个上调，901个下调），为后续富集分析和关键基因筛选奠定了基础。
转录组差异表达基因的GO和KEGG富集图，数据来自图2C和图2D。图2C显示DEGs主要富集在酸分解代谢、转运等生物学过程；图2D富集到细菌趋化性、牛磺酸和次牛磺酸代谢、ABC转运体等通路，初步揭示了大肠杆菌酸胁迫响应的核心生物学过程和信号通路。
蛋白质组测序的样本聚类树和差异表达蛋白火山图，数据来自图3A和图3B。图3A显示对照组和酸处理组样本分别聚类，证明蛋白定量结果可靠；图3B鉴定出379个差异表达蛋白（127个上调，252个下调），从蛋白层面补充了转录组的结果。
蛋白质组差异表达蛋白的GO和KEGG富集图，数据来自图3C和图3D。图3C显示DEPs主要富集在转运、膜、羧肽酶活性等功能；图3D富集到牛磺酸和次牛磺酸代谢、群体感应、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢等通路，与转录组结果相互印证。
转录组和蛋白质组关联分析的韦恩图和九象限图，数据来自图4A和图4B。图4A显示有115个基因/蛋白在两个组学中共同差异表达；图4B展示了基因和蛋白表达趋势的相关性，其中587个基因/蛋白表达趋势一致（243个上调，344个下调），提高了关键因子筛选的准确性。
转录组和蛋白质组共同富集的GO和KEGG图，数据来自图5A和图5B。图5A显示共同富集在转运活性、跨膜转运等功能；图5B富集在次生代谢产物生物合成、代谢途径、双组分系统等通路，整合了两个层面的信息，明确了酸胁迫响应的核心调控网络。
表达趋势一致的耐酸性相关差异基因和蛋白数据，数据来自表1。列出了18个关键耐酸性因子，包括asr、gadA、gadB、speF、potE、dps等，证实了Gad和Orn系统、酸休克蛋白、DNA保护蛋白在大肠杆菌耐酸性中的核心作用。
表达趋势一致的毒力相关差异基因和蛋白数据，数据来自表2。列出了23个毒力因子，其中76.9%与运动功能相关且均显著下调，同时发现lpxC、csgD、opmA等少数上调的毒力因子，全面揭示了酸胁迫对大肠杆菌毒力的复杂影响。
qRT-PCR验证关键基因表达水平的数据，数据来自图6。验证了5个耐酸性基因（asr、speF、gadA、gadB、tnaA）和5个毒力基因（fimB、entE、fliK、flhB、motB）的表达趋势与转录组结果完全一致，证明了组学测序数据的可靠性和准确性。
8. 结论
婴儿配方奶粉加工环境中大肠杆菌污染风险较高，主要污染位点为原料乳、设备表面和地漏，分离株具有丰富的遗传多样性，共分为19个ST型，其中ST10为优势流行型。酸胁迫下，大肠杆菌主要通过激活谷氨酸依赖型（Gad）和鸟氨酸依赖型（Orn）酸耐受系统来维持胞内pH稳态，同时酸休克蛋白Asr防止细胞失活，Dps蛋白保护DNA免受酸诱导断裂，ClpP和DegP蛋白酶降解错误折叠蛋白，OmpF和TnaA的下调也有助于增强耐酸性。酸胁迫后大肠杆菌大多数毒力因子尤其是运动相关因子的表达显著下调，但少数与抗生素抗性、生物膜形成和黏附相关的因子表达上调，提示其致病性可能发生复杂变化。本研究结果为婴儿配方奶粉加工企业制定针对性的清洁消毒措施和开展食品安全风险评估提供了重要的理论依据。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen FP-1100-C自动微生物生长曲线分析仪测定了56株大肠杆菌在不同pH条件下的生长曲线，每15分钟自动测定一次OD600值，连续监测48小时。这些高通量、高时间分辨率的生长数据是整个研究的基础，具有以下不可替代的研究意义：
实现大样本量的高效耐酸性筛选：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定上百个样品的生长曲线。本研究中56株菌×4个pH梯度×3次生物学重复的大规模实验得以在相同培养条件下高效完成，这是传统平板计数法无法实现的，为快速筛选耐酸性最强的EC56菌株提供了技术保障。
获得精准的生长动力学参数：通过连续监测获得的完整生长曲线，可以准确计算出延迟期、最大比生长速率、平台期OD值等关键生长动力学参数。这些参数能够定量描述酸胁迫对大肠杆菌生长的抑制程度，明确了pH4.0为合适的酸胁迫实验条件，为后续转录组和蛋白质组实验的设计提供了重要依据。
保证实验条件的高度一致性：仪器能够自动控制温度（37℃）、振荡频率和测量时间，消除了人工操作带来的系统误差，确保所有菌株在完全相同的培养条件下生长。这大大提高了不同菌株间耐酸性比较的准确性和实验结果的重复性。
动态监测细菌的酸适应过程：实时记录的生长曲线可以清晰展示大肠杆菌在酸胁迫下的生理适应过程，如延迟期的变化、对数生长期的启动时间和生长速率等。这些表型特征为理解细菌的酸适应机制提供了重要的表型基础，也为后续组学数据的解释提供了参考。
建立标准化的耐酸性评估方法：本研究建立的基于Bioscreen C的大肠杆菌耐酸性测定方法具有良好的通用性和可重复性，可作为该领域研究的标准方法。该方法不仅适用于大肠杆菌，还可推广应用于其他食源性致病菌的耐酸性评估，为不同实验室间的数据比较和整合提供了统一的技术规范。
为后续实验提供科学的取样依据：通过EC56在不同pH下的生长曲线，准确确定了其在正常和酸胁迫条件下的对数末期时间点，确保转录组和蛋白质组测序的样品取自相同的生长阶段，排除了生长阶段差异对基因和蛋白表达的影响，保证了组学结果的科学性和可比性。