Phenotypic heterogeneity and pathogenicity of Listeria monocytogenes under complex salinities of bile salts and sodium salts stress
胆汁盐和钠盐复合盐胁迫下单核细胞增生李斯特菌的表型异质性和致病性
来源：Archives of Microbiology (2025) 207:101
1. 摘要
单核细胞增生李斯特菌是一种广泛存在于环境和食品中的食源性致病菌，可引起人畜共患病。既往研究已探索了其在多种环境胁迫下的生长特性，但对胆汁盐与钠盐复合作用下的行为了解甚少。本研究旨在探究不同盐度条件（脑心浸液BHI、含0.90% NaCl的BHI、含0.50% NaCl+0.04%胆汁盐的BHI、含0.90% NaCl+0.04%胆汁盐的BHI）对李斯特菌生长、运动性、生物膜形成及毒力的影响，并人工模拟了猪肉样品中的李斯特菌污染场景。结果表明，复合盐处理显著降低了李斯特菌分离株的最大比生长速率，显著延长了延迟期，表现出更强的生长异质性；其中4b血清型分离株在复合盐胁迫下展现出较强的抗性。随着复合盐度升高，李斯特菌的生物膜形成能力显著下降，运动性受到抑制，但致病性增强，尤以1/2c血清型分离株最为明显。此外，复合盐还会导致李斯特菌细胞膜损伤。在猪肉样品中，李斯特菌可大量繁殖，而添加胆汁盐形成复合盐环境后其生长受到显著抑制。这些结果揭示了复合盐胁迫下单核细胞增生李斯特菌的表型异质性和致病性变化规律，为食品安全风险评估和病原体防控提供了重要依据。
2. 关键词
单核细胞增生李斯特菌、风险评估、生长、运动性、生物膜、盐胁迫
3. 研究目的
填补胆汁盐与钠盐复合胁迫对单核细胞增生李斯特菌表型和致病性影响的研究空白；系统分析不同复合盐度条件下李斯特菌在生长、运动性、生物膜形成等方面的表型异质性，明确其与菌株血清型、来源的关联；揭示复合盐胁迫对李斯特菌致病性的影响及潜在机制；模拟实际猪肉污染场景，评估复合盐在食品基质中对李斯特菌生长的调控效果；为单核细胞增生李斯特菌的精准风险评估和食品安全防控策略制定提供科学数据和理论支撑。
4. 研究思路
首先从实验室前期建立的147株李斯特菌库中，基于最优生长条件下的延迟期和最大比生长速率，筛选出40株代表性分离株（20株食品源、20株临床源，涵盖1/2a、1/2b、1/2c、4b四种主要血清型）。设置四种盐度处理组模拟不同环境条件：BHI基础培养基（0.50% NaCl）、0.90% NaCl、0.50% NaCl+0.04%胆汁盐、0.90% NaCl+0.04%胆汁盐。采用芬兰Bioscreen C微生物生长曲线分析仪测定40株菌在各处理下的生长曲线，通过修正的Gompertz模型拟合得到最大比生长速率和延迟期，计算变异系数评估生长异质性。通过软琼脂平板法测定40株菌的运动性直径，分析盐度对运动能力的影响。选取8株生长特性不同的代表性菌株，利用结晶紫染色法结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜形成的动态过程和结构变化；采用THP-1巨噬细胞模型，通过CCK-8法测定细胞抑制率以评估菌株毒力变化。选取2株1/2b血清型菌株，通过活/死细菌染色CLSM观察和扫描电镜（SEM）分析，检测复合盐对细胞膜完整性和细菌形态的影响。最后在新鲜猪肉样品中模拟污染，测定添加0.01%胆汁盐前后李斯特菌的生长曲线，验证复合盐在实际食品中的抑菌效果。综合所有实验数据，分析复合盐胁迫下李斯特菌的表型异质性和致病性变化规律。
5. 研究亮点
首次系统开展了胆汁盐与钠盐复合胁迫对单核细胞增生李斯特菌多表型的影响研究，明确了两者的协同抑菌效应，填补了该领域的研究空白。
采用大样本量（40株）多维度分析，量化了复合盐胁迫下的生长异质性，揭示了生长特性与菌株血清型、来源的关联，发现4b血清型和临床分离株具有更强的复合盐抗性。
发现了"胁迫抑制生长但增强致病性"的重要现象：复合盐虽然显著抑制李斯特菌的生长、运动性和生物膜形成，但显著提升了其对巨噬细胞的毒性，尤其是1/2c血清型，这一发现对传统风险评估认知形成了重要补充和警示。
结合体外纯培养实验与实际食品（猪肉）模拟实验，验证了胆汁盐作为天然抑菌剂在食品中的应用潜力，为开发新型食品防腐技术提供了新思路。
运用多种显微技术（CLSM、SEM）从细胞形态和超微结构层面，直观揭示了复合盐通过破坏细胞膜完整性发挥抑菌作用的机制。
6. 可延伸的方向
从转录组、蛋白质组和代谢组层面，系统解析复合盐胁迫下李斯特菌的分子响应机制，鉴定关键调控基因和信号通路，阐明其胁迫适应和毒力增强的分子基础。
研究温度、pH、水分活度等食品加工和储存关键因素与复合盐的交互作用，模拟更真实的食品链和胃肠道环境，完善风险评估模型。
开展动物体内实验，评估复合盐胁迫下存活的李斯特菌的体内致病性、定植能力和传播风险，验证体外毒力实验结果。
探索胆汁盐与植物提取物、乳酸菌素等天然抑菌剂的协同作用，开发高效、安全的复合抑菌配方，应用于肉制品加工和保鲜。
调查不同食品基质（如乳制品、水产品、即食食品）中李斯特菌对复合盐的响应差异，建立针对性的基质特异性防控策略。
研究李斯特菌在长期低剂量复合盐胁迫下的适应性进化规律，评估其产生稳定抗性和毒力增强的潜在风险。
基于本研究获得的生长和毒力参数，优化单核细胞增生李斯特菌的定量风险评估模型，提高预测的准确性和可靠性。
7. 测量的数据及其研究意义
40株单核细胞增生李斯特菌在四种盐度条件下的生长曲线及拟合得到的最大比生长速率（μmax）和延迟期（LT）数据，数据来自图1a、e。该数据定量揭示了复合盐对李斯特菌生长的抑制作用，通过计算μmax的变异系数明确了复合盐胁迫下生长异质性显著增强，同时发现4b血清型菌株生长速率更快、临床分离株延迟期更短，为风险评估提供了核心的生长动力学参数。
40株李斯特菌在四种盐度下的运动性直径数据，数据来自图2a-d。该数据表明0.90% NaCl可适度增强李斯特菌的运动性，而胆汁盐显著抑制运动性；食品源菌株的运动性强于临床源，1/2a和1/2c血清型在0.90% NaCl下运动能力更强，为理解李斯特菌在环境和食品中的传播、定植能力提供了依据。
8株代表性菌株在四种盐度下的生物膜形成动态数据及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结构图像，数据来自图4a-j。该数据显示复合盐显著降低生物膜生物量并使其结构变得稀疏松散，多数菌株在复合盐下提前达到最大生物膜量，且不同血清型的响应存在差异，为制定生物膜防控措施提供了参考。
8株菌株对THP-1巨噬细胞的抑制率数据，数据来自图3a-h。该数据首次证实复合盐胁迫会增强李斯特菌的致病性，尤其是1/2c血清型菌株的毒力提升最为显著，这一发现纠正了"胁迫抑制生长即降低风险"的片面认知，对食品安全风险评估具有重要警示意义。
2株1/2b血清型菌株的细胞膜损伤CLSM图像和细菌形态扫描电镜（SEM）图像，数据来自图5。该数据直观证明了复合盐会破坏李斯特菌的细胞膜完整性，导致细菌形态畸形、表面粗糙、内容物泄漏，从细胞超微结构层面解释了复合盐的抑菌机制。
2株菌株在猪肉样品中添加胆汁盐前后的生长曲线及拟合的μmax和LT数据，数据来自图6a-c和补充图1。该数据验证了胆汁盐在实际食品基质中的抑菌效果，表明其可有效抑制李斯特菌在猪肉中的繁殖，为胆汁盐作为食品抑菌剂的应用提供了直接的实验支持。
8. 结论
胆汁盐与钠盐的复合作用显著抑制了单核细胞增生李斯特菌的生长、运动性和生物膜形成能力，并造成细胞膜损伤，但同时显著增强了其致病性，导致菌株间出现高度的表型和毒力异质性。在复合盐胁迫下存活的优势菌株（如4b血清型）具有更强的环境适应性，可能对人类健康构成更大的潜在威胁。在猪肉样品中，添加胆汁盐形成的复合盐环境可显著抑制李斯特菌的生长，显示出胆汁盐作为天然食品抑菌剂的应用潜力。本研究结果为单核细胞增生李斯特菌的精准风险评估和食品安全防控提供了重要的数据支持，但仍需进一步研究温度、pH等环境因素与复合盐的交互作用，并从分子层面深入解析其胁迫适应和毒力调控机制。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C微生物生长曲线分析仪测定了40株单核细胞增生李斯特菌在四种盐度条件下的生长曲线，每间隔固定时间自动记录OD600值，连续监测24-72小时。这些高时间分辨率、高通量的生长数据是整个研究的核心基础，具有以下不可替代的研究意义：
实现大样本量的高效生长分析：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定上百个样品的生长曲线。本研究中40株菌×4种处理×3次生物学重复的大规模实验得以在相同培养条件下高效完成，这是传统平板计数法无法实现的，为系统分析菌株间的生长异质性提供了充足的数据量和可靠的实验基础。
获得精准的生长动力学参数：通过修正的Gompertz模型对连续生长曲线进行拟合，得到了最大比生长速率（μmax）和延迟期（LT）两个关键参数。这些参数能够定量描述李斯特菌在不同盐度下的生长能力，是微生物定量风险评估模型的核心输入数据，直接影响风险评估结果的准确性。
量化菌株间的生长异质性：通过计算不同处理下μmax的变异系数（CV），明确了复合盐胁迫会显著增大李斯特菌的生长异质性，其中0.90% NaCl+0.04%胆汁盐条件下CV值最高。这一发现强调了在风险评估中必须考虑菌株异质性，避免使用单一菌株数据导致评估结果偏倚。
揭示复合盐的协同抑菌效应：通过比较单一钠盐（0.90% NaCl）和复合盐（NaCl+胆汁盐）处理下的生长参数，证明了胆汁盐与钠盐具有协同抑菌作用，两者共同作用时对生长的抑制效果远强于单一盐类。这一结果为理解李斯特菌在人体胃肠道（同时存在胆汁盐和钠盐）中的生存挑战提供了实验依据。
建立菌株表型与背景的关联：基于生长曲线数据，分析了不同来源（食品/临床）和血清型菌株的生长特性差异，发现临床分离株在复合盐下的延迟期更短，4b血清型菌株的生长速率更快。这些关联为解释不同菌株的流行病学特征和致病潜力提供了重要线索。
为后续实验提供科学的菌株筛选依据：根据生长曲线数据，本研究筛选出8株生长特性不同（生长快/慢、抗性强/弱）的代表性菌株进行后续的毒力、生物膜、细胞膜损伤等实验，确保了后续研究结果的代表性和全面性。
提供标准化的实验方法学平台：本研究建立的基于Bioscreen C的李斯特菌生长测定方法具有良好的重复性和可比性，可作为该领域研究的标准方法，为不同实验室间的数据比较和整合提供了统一的技术规范。