Exposure-driven adaptation of Listeria monocytogenes to disinfectants yields distinct resistance phenotypes depending on the strain
单核细胞增生李斯特菌对消毒剂的暴露驱动适应产生因菌株而异的耐药性表型
来源：Foods 2025, 14, 2955.
1. 摘要
食品加工环境中单核细胞增生李斯特菌的耐药性问题日益突出，尤其是消毒剂使用不当时更为严重。本研究测定了20株李斯特菌对苯扎氯铵（BKC）、过氧乙酸（PAA）和次氯酸钠（HS）三种常用消毒剂的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），并通过逐步递增亚抑菌浓度暴露的方式，评估了消毒剂暴露对菌株耐药性谱的影响。结果显示，所有菌株适应后MIC和MBC均显著升高，增幅达0.77-155.93倍，其中工业环境分离株的耐受性提升更为显著。主成分分析（PCA）证实了适应过程的菌株依赖性特征：适应后菌株的表型谱发生明显整体偏移且变异性显著增加，而野生型菌株的敏感性模式更为均一。研究表明，亚抑菌浓度的消毒剂暴露会促进李斯特菌耐受性的发展，可能对食品工业卫生消毒方案的有效性产生负面影响，因此严格管控消毒剂的使用对于防止耐药菌株的产生和持续存在至关重要。
2. 关键词
苯扎氯铵、过氧乙酸、次氯酸钠、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度
3. 研究目的
表征19株不同来源（标准参考菌株、伊比利亚猪肉加工环境分离株）的单核细胞增生李斯特菌对三种主流工业消毒剂的基础敏感性谱，分析菌株来源与基础耐药性的关联。
评估逐步暴露于递增亚抑菌浓度消毒剂对李斯特菌耐药性的影响，量化不同菌株对三种消毒剂的适应性差异，探究潜在的交叉耐药模式。
从整体表型层面揭示消毒剂暴露导致的菌株适应性变化特征，为食品工业制定科学合理的消毒方案、防止耐药菌株流行提供理论依据和数据支撑。
4. 研究思路
首先收集19株单核细胞增生李斯特菌，包括5株西班牙典型培养物保藏中心（CECT）的参考菌株和14株食品加工环境分离株，进行复苏、纯化和甘油保藏。然后配制三种消毒剂的梯度工作液，采用芬兰Bioscreen C微生物生长曲线分析仪，按照CLSI标准的微量肉汤稀释法，测定野生型菌株在37℃培养48小时后的MIC值；对无生长的孔进行平板涂布，培养后测定MBC值。
接着建立逐步亚抑菌浓度适应模型：以各菌株对应消毒剂的1/2 MIC为起始浓度，每24小时传代一次，每次将消毒剂浓度提高1.5倍，直至菌株72小时内不再生长，收集最后一代有生长的菌株作为适应株，在含相应消毒剂的培养基中保藏。随后用相同方法测定所有适应株的MIC和MBC值，计算与野生型的倍数变化。
最后通过主成分分析（PCA）整合所有菌株的MIC数据，比较野生型和适应株的整体表型差异；采用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后检验进行统计学分析，评估菌株间差异的显著性。
5. 研究亮点
首次系统比较了19株不同来源李斯特菌对三种工业消毒剂的基础耐药性和适应性差异，发现李斯特菌对次氯酸钠（HS）的适应性显著弱于苯扎氯铵（BKC）和过氧乙酸（PAA），为工业消毒剂的优先选择提供了直接依据。
量化了不同菌株的适应性差异，发现部分工业分离株对BKC的MIC可提升155倍以上，证实了长期工业消毒压力对菌株耐药性的强烈选择作用，揭示了工业环境中耐药菌株流行的重要原因。
通过主成分分析从整体表型层面证实了消毒剂暴露导致的菌株耐药性偏移和异质性增加，明确了适应过程的菌株依赖性特征，打破了“所有菌株适应模式一致”的传统认知。
采用标准化的高通量测定方法，获得了大量可靠的MIC和MBC数据，为食品工业消毒浓度的制定和调整提供了关键的基准数据。
6. 可延伸的方向
结合全基因组测序和转录组学技术，解析不同菌株消毒剂适应性差异的分子机制，鉴定关键耐药基因（如外排泵基因、膜蛋白基因）和调控通路。
研究消毒剂适应株与临床常用抗生素的交叉耐药性，评估其对公共卫生的潜在威胁，特别是免疫低下人群的感染风险。
探究生物膜状态下李斯特菌对消毒剂的适应性，比较浮游菌和生物膜菌的耐药性差异，优化针对生物膜的消毒方案。
评估不同消毒策略（如消毒剂轮换、联合使用、冷热交替消毒）对防止耐药菌株产生的效果，建立可推广的工业消毒优化方案。
开展全国范围内食品加工环境中耐药李斯特菌的流行病学调查，追踪其传播途径和进化规律，建立耐药监测网络。
研究消毒剂适应株的毒力变化，通过细胞实验和动物模型评估其致病性的改变，全面评估其食品安全风险。
7. 测量的数据及其研究意义
19株野生型李斯特菌对三种消毒剂的MIC和MBC数据，数据来自图1（A-F）。图1A和1B分别为BKC的MIC和MBC分布，图1C和1D为PAA的MIC和MBC分布，图1E和1F为HS的MIC和MBC分布。这些数据揭示了不同菌株对消毒剂的基础敏感性差异：工业分离株普遍比参考菌株具有更高的基础耐药性，三种消毒剂的杀菌效力依次为BKC > PAA > HS，为工业消毒剂的选择和初始使用浓度的制定提供了基准数据。
19株李斯特菌对三种消毒剂的最大耐受适应浓度数据，数据来自表2。表2列出了每株菌在逐步暴露后能存活的最高消毒剂浓度，显示所有菌株都能适应高于初始MIC的BKC和PAA浓度，但对HS的适应浓度普遍低于其初始MIC。这一原创性发现首次证实了李斯特菌对HS的适应性显著弱于另外两种消毒剂，为工业优先使用HS作为消毒剂提供了有力证据。
19株适应株对三种消毒剂的MIC和MBC数据及与野生型的倍数变化，数据来自图2（A-F）和表3。图2展示了适应株的MIC和MBC分布，表3量化了每株菌的具体增幅：对BKC的增幅最大（最高155.93倍），PAA次之（最高98.61倍），HS最小（最高2.32倍）。这些数据直观展示了不同菌株的适应能力差异，工业分离株的增幅显著高于参考菌株，进一步证实了长期工业消毒压力的选择作用。
野生型和适应株的主成分分析数据，数据来自图3。图3的PCA双标图显示，野生型菌株聚类紧密，而适应株明显分散且整体向高耐药方向偏移，前两个主成分解释了90.38%的总方差。这一结果从整体表型层面证实了消毒剂暴露导致的菌株耐药性改变和异质性增加，清晰展示了适应过程的菌株依赖性特征。
8. 结论
本研究证实，长期暴露于亚抑菌浓度的苯扎氯铵、过氧乙酸和次氯酸钠会导致单核细胞增生李斯特菌发生显著的表型改变，大幅提高其对消毒剂的耐受性。所有适应株尤其是食品加工环境分离株的MIC和MBC值均显著高于野生型，表明工业环境中不规范的消毒操作已对菌株产生了强烈的选择作用。不同菌株的适应性响应存在显著差异，部分菌株对苯扎氯铵的耐受性可提升150倍以上，而对次氯酸钠的适应性最弱。主成分分析清晰区分了野生型和适应株的表型谱，证实了亚抑菌浓度暴露会导致菌株产生独特且异质的耐药性特征。这些发现强调了食品工业中正确使用消毒剂的极端重要性：不当使用不仅会降低消毒效果，还会筛选和保留高耐药菌株，增加食品安全风险。未来应加强对工业环境中耐药李斯特菌的监测，推广消毒剂轮换和精准浓度控制策略，以防止耐药性的进一步发展和传播。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪完成了所有野生型和适应株的MIC测定实验，该仪器的应用对本研究的科学性和可靠性具有不可替代的关键意义：
实现高通量、自动化的批量MIC测定：Bioscreen C采用100孔蜂窝板设计，可同时测定96个样品的生长曲线。本研究需要测定19株菌对3种消毒剂的8-12个梯度浓度，每个设置3次生物学重复和3次技术重复，总计超过2000个样品。这种高通量能力将传统试管法需要数周的工作量压缩至数天完成，极大提高了实验效率，同时避免了多批次实验带来的系统误差。
提供高时间分辨率的生长动态数据：仪器每30分钟自动测定一次420-580nm范围内的光密度值，连续监测48小时，每次测量前自动进行中等强度振荡混匀。这种连续监测获得了完整的细菌生长曲线，能够准确捕捉细菌的延迟期、对数期和稳定期变化，避免了传统终点法仅在48小时观察一次可能出现的假阴性（如生长延迟）或假阳性（如浑浊沉淀）结果，确保了MIC值判定的准确性。
保证实验条件的高度均一性：仪器内置恒温培养系统，精确控制温度在37±0.1℃，所有孔位的温度差异小于0.5℃；同时统一控制振荡频率和测量时间，所有菌株在完全相同的条件下培养。这消除了环境波动和人工操作带来的误差，使得不同菌株、不同消毒剂、不同批次之间的MIC结果具有高度可比性，为后续的统计学分析和差异比较提供了可靠的数据基础。
实现MIC的客观定量判定：通过仪器自动读取的OD值变化来判定MIC，即最低消毒剂浓度下48小时的OD增量与阴性对照组无统计学差异。这种客观判定方法避免了传统肉眼观察浊度的主观性，不同实验人员的判定结果一致性达到100%，显著提高了结果的准确性和可重复性。
为适应实验提供精准的基准数据：Bioscreen测定的野生型菌株MIC值是后续逐步亚抑菌浓度暴露实验的核心基准。准确的MIC值确保了适应实验从1/2 MIC的合适起始浓度开始，避免了起始浓度过高导致菌株全部死亡或过低导致适应过程缓慢且无选择压力，保证了适应实验的顺利进行和结果的有效性。
建立标准化的李斯特菌消毒剂敏感性测定方法：本研究建立的基于Bioscreen C的微量肉汤稀释法具有良好的通用性和可重复性，可作为李斯特菌消毒剂敏感性测定的标准方法。该方法已被多个国际实验室采用，便于不同研究之间的数据比较和交流，推动了李斯特菌耐药性研究的标准化进程。