Antibiofilm activity of rosmarinic acid against Vibrio parahaemolyticus in vitro and its efficacy in food systems
迷迭香酸对副溶血弧菌的体外抗生物膜活性及其在食品系统中的疗效
来源：Food Bioscience 68 (2025) 106750
1. 摘要
副溶血弧菌是与海鲜传播疾病密切相关的重要食源性致病菌，其强大的生物膜形成能力使其能耐受常规消毒剂，增加了在食物链中的持续污染风险。目前广泛使用的化学消毒剂存在潜在健康隐患，且不当使用可能加剧细菌耐药性的产生，因此亟需开发高效、安全的天然抗生物膜替代剂。迷迭香酸（RA）是一种广泛应用于化妆品、制药和食品工业的天然多酚类化合物，已被证实具有良好的抗菌活性，但其抗生物膜作用尤其是针对副溶血弧菌的研究尚未见报道。本研究旨在评估亚抑菌浓度RA对副溶血弧菌生物膜形成的影响，通过检测生物膜微观结构、胞外聚合物组分、细菌运动性、群体感应及相关基因表达水平探究其作用机制，并验证其在食品系统中的应用潜力。结果表明，亚抑菌浓度RA能显著抑制副溶血弧菌在实验室培养基和食品基质中的生物膜形成，抑制率达19.41%-68.97%；同时能降低细菌运动性、自诱导物-2（AI-2）分泌、胞外聚合物产生及生物膜细胞代谢活性。RA可有效减少多种食品表面（7.95%-26.72%）和食品接触表面（>9.42%）的生物膜生物量，实时荧光定量PCR显示其能下调生物膜相关基因的转录水平，分子对接实验进一步证实RA可直接与生物膜关键调控蛋白RcpA结合。综上，本研究鉴定迷迭香酸为潜在的副溶血弧菌天然抗生物膜剂，为其在食品工业中的应用提供了理论依据。
2. 关键词
副溶血弧菌、抗生物膜、迷迭香酸、胞外聚合物、食品表面
3. 研究目的
测定迷迭香酸对副溶血弧菌的最低抑菌浓度（MIC）和亚抑菌浓度（SIC），确定其抗生物膜作用的安全有效浓度范围。
系统评估亚抑菌浓度RA对副溶血弧菌生物膜形成的抑制效果，包括对生物膜生物量、代谢活性及微观结构的影响。
从细菌运动性、细胞疏水性、胞外聚合物（EPS）分泌、群体感应系统及相关基因表达等多个层面，揭示RA抗生物膜的分子作用机制。
验证RA在真实食品基质（牡蛎汁、鲈鱼汁）、多种食品接触表面（玻璃、硅胶、聚苯乙烯）及食品表面（虾、鲈鱼、蛏子）的抗生物膜效果，评估其实际应用价值。
通过分子对接预测RA与生物膜关键调控蛋白的相互作用，为后续靶点研究和抗生物膜剂开发提供方向。
4. 研究思路
首先采用微量肉汤稀释法和芬兰Bioscreen C自动生长曲线分析仪，测定RA对两株副溶血弧菌（ATCC17802和RIMD2210633）的MIC和SIC，筛选出对细菌生长无显著抑制的三个亚抑菌浓度用于后续实验。然后通过结晶紫染色法和XTT还原法，分别检测RA在3% NaCl LB培养基、牡蛎汁和鲈鱼汁中对生物膜生物量和代谢活性的抑制作用。利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察RA处理后生物膜微观结构和细胞形态的变化。
接着检测RA对副溶血弧菌游泳运动性、细胞表面疏水性、EPS组分（胞外多糖、胞外蛋白、eDNA）含量及群体感应分子AI-2分泌的影响。随后评估RA在玻璃、硅胶、聚苯乙烯等食品接触表面以及虾、鲈鱼、蛏子等食品表面的抗生物膜效果，通过平板计数法定量生物膜活菌数。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析RA处理后生物膜相关基因（鞭毛合成、群体感应、EPS合成及调控基因）的表达变化。最后通过分子对接模拟RA与生物膜关键蛋白RcpA的相互作用，预测其结合模式和亲和力。综合所有实验结果，阐明RA抗副溶血弧菌生物膜的作用机制及应用潜力。
5. 研究亮点
首次系统报道了迷迭香酸对副溶血弧菌的抗生物膜活性，填补了该天然产物在食源性致病菌生物膜防控领域的研究空白。
采用多维度、多层次的研究方法，从宏观生物量检测到微观结构观察，从表型特征分析到分子机制探究，全面揭示了RA抗生物膜的作用靶点和调控通路。
证实RA在亚抑菌浓度下即可发挥显著抗生物膜作用，不会对细菌产生杀菌压力，从源头上降低了诱导细菌耐药性的风险，符合食品安全和公共卫生要求。
验证了RA在多种真实食品系统中的抗生物膜效果，包括液体食品基质、固体食品表面及常见食品接触材料，为其在食品加工、保藏和消毒环节的实际应用提供了直接数据支持。
发现RA可通过直接结合生物膜关键调控蛋白RcpA发挥作用，为新型抗生物膜剂的分子设计和靶点筛选提供了重要参考。
6. 可延伸的方向
研究RA与其他天然抗菌剂（如植物精油、有机酸、 bacteriocin）或低浓度化学消毒剂的协同抗生物膜效果，开发高效复合抗生物膜制剂，降低单一药剂的使用浓度和成本。
探究RA对副溶血弧菌成熟生物膜的清除作用，以及对食品加工环境中常见的混合菌种生物膜（如副溶血弧菌与单增李斯特菌、铜绿假单胞菌共存）的影响。
结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，全面解析RA抗生物膜的全局调控网络，发现更多潜在的作用靶点和信号通路。
开发RA的新型递送系统，如纳米乳液、微胶囊、可食性抗菌包装膜等，提高其在食品中的稳定性、分散性和缓释性能，延长作用时间。
评估RA在实际食品加工生产线中的长期应用效果，以及对食品感官品质（色泽、风味、质地）和营养成分的影响，制定标准化的应用方案。
研究RA对副溶血弧菌毒力因子（如溶血素、黏附素、分泌系统）表达的影响，并通过动物感染模型评估其体内抗感染效果。
拓展RA的抗菌谱，研究其对其他重要食源性致病菌（如沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌）的抗生物膜活性，扩大其应用范围。
7. 测量的数据及其研究意义
不同浓度RA对两株副溶血弧菌的生长曲线数据，数据来自图1（A和B）。图1显示RA对ATCC17802和RIMD2210633的MIC均为2 mg/mL，0.0625、0.125和0.25 mg/mL为亚抑菌浓度，对细菌生长无显著抑制。这些数据准确界定了后续抗生物膜实验的浓度范围，确保实验结果是由RA的抗生物膜作用而非杀菌作用引起的。
RA对实验室培养基和食品基质中生物膜生物量的影响数据，数据来自图2（A-D）。图2A-B显示RA在3% NaCl LB培养基中对两株菌的生物膜抑制率分别为27.1%-58.71%和33.81%-61.43%；图2C-D显示在牡蛎汁中抑制率达39.86%-68.31%，在鲈鱼汁中达19.42%-39.89%。这些数据直接证明了RA在不同基质中均具有显著的抗生物膜活性，且在食品基质中效果更为突出。
RA对生物膜细胞代谢活性的影响数据，数据来自图3（A-D）。图3显示RA能浓度依赖性地降低生物膜细胞的代谢活性，在实验室培养基中抑制率为27.68%-44.05%，在牡蛎汁和鲈鱼汁中分别为25.35%-48.73%和23.78%-47.8%。这些数据补充了结晶紫染色的结果，表明RA不仅减少生物膜的总生物量，还能显著降低存活细胞的代谢水平。
RA处理后生物膜的CLSM图像数据，数据来自图4。图4显示对照组生物膜结构致密，活细胞（绿色荧光）占绝大多数；RA处理后生物膜变薄，死细胞（红色荧光）比例显著增加。这些直观的图像数据从细胞存活状态的角度证实了RA对生物膜的破坏作用。
RA处理后生物膜的FESEM图像数据，数据来自图5。图5显示对照组生物膜形成了复杂的三维结构，细胞聚集紧密且有大量EPS包裹；RA处理后细胞分散稀疏，EPS分泌明显减少，生物膜结构松散。这些高分辨率的微观结构图像进一步从形态学角度揭示了RA的抗生物膜机制。
RA对副溶血弧菌游泳运动性的影响数据，数据来自图6（A-D）。图6显示RA能显著减小细菌的游泳圈直径，对ATCC17802的抑制率为11.50-43.05 mm，对RIMD2210633为12.03-40.73 mm。运动性是细菌初始粘附和生物膜形成的关键步骤，这些数据表明RA通过抑制运动性减少细菌在表面的定植。
RA对副溶血弧菌细胞表面疏水性的影响数据，数据来自图7（A和B）。图7显示RA能降低细胞疏水性，抑制率分别为22.27%-26.31%（ATCC17802）和19.71%-48.06%（RIMD2210633）。细胞疏水性与细菌粘附能力密切相关，这些数据进一步解释了RA抑制生物膜初始形成的机制。
RA对生物膜EPS组分的影响数据，数据来自图8（A-F）。图8显示RA能显著减少EPS中胞外多糖（43.21%-67.79%）、胞外蛋白（26.31%-40.17%）和eDNA（22.24%-33.99%）的含量。EPS是生物膜的主要结构成分，这些数据表明RA通过破坏生物膜的基质骨架来抑制其形成和维持。
RA对群体感应分子AI-2分泌的影响数据，数据来自图9（A-C）。图9显示0.0625和0.125 mg/mL RA处理后，AI-2活性分别降低了31.60%和28.51%。群体感应系统调控生物膜的成熟和分化，这些数据表明RA通过干扰群体感应来抑制生物膜的发展。
RA在不同食品接触表面和食品表面的抗生物膜效果数据，数据来自图10（A-D）。图10显示RA能有效减少玻璃、硅胶、聚苯乙烯表面的生物膜活菌数（7.95%-26.72%），以及虾、鲈鱼、蛏子表面的生物膜（9.42%-34.87%）。这些数据验证了RA在实际食品加工和保藏场景中的应用价值。
RA对生物膜相关基因表达的影响数据，数据来自图11（A-F）。图11显示0.25 mg/mL RA能显著下调鞭毛基因（flaA、fliR）、群体感应基因（luxS、aphA）、EPS合成基因（cpsA）及调控基因（VP0950、rcpA）的表达，下调倍数为1.58-7.69倍。这些数据从基因水平阐明了RA抗生物膜的分子机制。
RA与RcpA蛋白的分子对接数据，数据来自图12。图12显示RA与RcpA的结合能为-6.084 kcal/mol，形成了6个氢键、1个静电相互作用和1个Pi-Pi T型相互作用。这些数据预测了RA的直接作用靶点，为后续机制研究提供了重要线索。
8. 结论
亚抑菌浓度的迷迭香酸能有效抑制副溶血弧菌的生物膜形成，其作用机制是多靶点的：通过抑制细菌游泳运动性和细胞表面疏水性减少初始粘附；通过减少胞外多糖、胞外蛋白和eDNA的分泌破坏生物膜基质结构；通过降低群体感应分子AI-2的活性干扰细胞间通讯；并在转录水平上下调生物膜相关基因的表达。RA不仅在实验室培养基中表现出优异的抗生物膜活性，在牡蛎汁、鲈鱼汁等食品基质以及玻璃、硅胶、聚苯乙烯等食品接触表面和虾、鲈鱼、蛏子等食品表面均能显著减少生物膜生物量。分子对接结果表明RA可直接与生物膜关键调控蛋白RcpA结合，进一步支持其抗生物膜作用。这些发现表明迷迭香酸作为一种天然、安全的食品添加剂，具有开发为新型抗生物膜剂的巨大潜力，可单独或与其他消毒剂联合使用，减少化学消毒剂的使用，降低食品安全风险。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪测定了不同浓度迷迭香酸对副溶血弧菌生长的影响，以确定亚抑菌浓度（SIC），该数据在本研究中具有以下关键意义：
精准界定抗生物膜实验的安全浓度范围：Bioscreen仪器每小时自动测定一次OD600值，连续监测24小时，获得了完整的细菌生长动力学曲线。通过对比不同RA浓度下的生长曲线，准确区分了抑菌浓度和亚抑菌浓度，确定0.0625、0.125和0.25 mg/mL为对细菌生长无显著抑制的SIC。这一界定至关重要，确保了后续所有抗生物膜实验都是在非杀菌条件下进行的，排除了RA的杀菌作用对生物膜减少的干扰，保证了实验结果的科学性和准确性。
提供高时间分辨率的生长动态信息：传统的终点法仅在培养24小时后测定一次OD值，无法反映细菌在不同生长阶段的变化。Bioscreen的连续监测能够捕捉到RA对细菌延迟期、对数生长期和稳定期的细微影响，验证了所选SIC确实不会改变细菌的正常生长速率和最终生物量，进一步确认了实验条件的合理性。
保证实验的高重复性和可比性：Bioscreen仪器采用全自动化操作，精确控制培养温度（37℃）、振荡频率和测量时间，所有样品在完全相同的条件下同时培养和检测。这消除了人工操作带来的系统误差，使得不同浓度、不同菌株之间的生长数据具有高度可比性，提高了实验结果的可靠性和可重复性。
为后续机制研究提供基础对照：准确的生长曲线数据是评估RA抗生物膜特异性的重要对照。通过对比RA对浮游菌生长和生物膜形成的影响差异，明确了RA的作用靶点是生物膜形成过程而非细菌的基本生长代谢，为后续深入研究其抗生物膜机制奠定了基础。
建立标准化的天然产物SIC测定方法：本研究建立的基于Bioscreen C的副溶血弧菌生长曲线测定和SIC筛选方法，具有操作简便、通量高、数据准确等优点，可作为其他天然产物抗生物膜研究中SIC测定的标准方法，便于不同研究团队之间的数据比较和交流，推动该领域研究的标准化进程。