Effect of exposure to sub-inhibitory concentrations of biocides on the susceptibility to antibiotics of sessile cells of Listeria monocytogenes and Salmonella enterica
暴露于亚抑制浓度的杀菌剂对单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌固着细胞抗生素敏感性的影响
来源：Food Control 168 (2025) 110881
1. 摘要
本研究探讨了食品工业常用五种消毒剂——过氧乙酸（PAA）、苯扎氯铵（BZK）、次氯酸钠（SHY）、聚维酮碘（PVI）和双(3-氨丙基)胺（BAPA）的亚抑菌浓度（MIC/2）对单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌固着细胞抗生素耐药性的影响。实验采用2株李斯特菌（LM30、LM28）和2株沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌ST、肠炎沙门氏菌SE），分别构建单种生物膜（MSB）和混合生物膜（MB，LM30+ST、LM28+SE）。结果显示，消毒剂暴露导致多株细菌的抗生素敏感性发生显著改变：LM30在混合生物膜中暴露于BAPA后，对四环素和红霉素从敏感转为耐药；LM28在单种生物膜中暴露于PVI后对四环素耐药，在混合生物膜中暴露于SHY和BAPA后对氨苄西林耐药；ST在单种和混合生物膜中暴露于SHY、PVI、BAPA后，对庆大霉素从中间耐药转为完全耐药；SE在两种生物膜中暴露于PAA后对头孢西丁从敏感转为中介。同时也观察到部分菌株对某些抗生素的敏感性增加的现象。研究表明，低浓度消毒剂接触会改变食源性致病菌生物膜细胞的抗生素耐药性，强调了食品企业必须使用足量消毒剂以避免细菌耐药性变化的重要性。
2. 关键词
单种生物膜、混合生物膜、杀菌剂、亚抑制剂量、抗生素耐药性
3. 研究目的
针对当前研究中缺乏亚抑制浓度消毒剂对生物膜（尤其是自然界中更常见的混合生物膜）中食源性致病菌抗生素耐药性影响的空白，系统评估五种不同作用机制的常用食品工业消毒剂对单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌单种及混合生物膜固着细胞抗生素敏感性的影响；分析生物膜类型（单种vs混合）、菌株差异和消毒剂种类对耐药性变化的调控作用；揭示生物膜环境下消毒剂与抗生素交叉耐药的风险，为食品加工环境中消毒剂的规范使用和细菌耐药性防控策略制定提供科学依据和实验支撑。
4. 研究思路
首先采用肉汤微量稀释法，利用芬兰Bioscreen C MBR微生物生长分析仪测定五种消毒剂对四株受试菌株的初始最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；然后在96孔光学底板中培养单种和混合生物膜，在培养基中加入MIC/2浓度的消毒剂，37℃湿室培养5天；随后使用显色选择性培养基从生物膜中分离纯化各菌株，再次采用肉汤微量稀释法测定分离菌株对10种临床常用抗生素的MIC和MBC；按照CLSI和EUCAST标准将菌株分为敏感、中介和耐药三类；最后通过Mann-Whitney U非参数检验对所有数据进行统计学分析，比较消毒剂暴露前后菌株抗生素敏感性的显著性差异，综合评估亚抑制浓度消毒剂对生物膜细胞耐药性的影响。
5. 研究亮点
首次同时系统研究了单种和混合生物膜中两种最重要食源性致病菌（李斯特菌和沙门氏菌）的抗生素耐药性变化，更贴近食品加工环境中细菌以混合生物膜形式存在的实际情况，研究结果具有更强的现实指导意义。
测试了五种不同作用机制的常用消毒剂，包括氧化性消毒剂（PAA、SHY）、阳离子表面活性剂（BZK）、碘制剂（PVI）和多胺类化合物（BAPA），全面覆盖了食品工业主要使用的消毒剂类型，揭示了不同消毒剂诱导耐药性的能力差异。
不仅证实了亚抑制浓度消毒剂会导致细菌抗生素耐药性增加，还首次在生物膜体系中系统观察到部分菌株对某些抗生素的敏感性显著增加的现象，为探索抗生素耐药性逆转机制和开发新型抗菌策略提供了新的方向。
实验设计严谨，所有实验均设置三次独立生物学重复，采用标准化的MIC测定方法和权威的耐药性判定标准，确保了研究结果的可靠性和可重复性。
明确了混合生物膜中不同菌种之间的相互作用会显著影响消毒剂诱导的抗生素耐药性变化，多数耐药性增强现象发生在混合生物膜中，提示未来研究应更加关注复杂微生物群落的耐药性问题。
6. 可延伸的方向
从分子水平深入探究生物膜中细菌抗生素耐药性变化的机制，重点研究外排泵过表达、细胞膜脂质成分改变、生物膜基质保护作用、基因水平转移以及群体感应系统在其中的作用。
研究不同暴露时间（从数小时到数周）和不同亚抑制浓度（MIC/10到MIC/2）对细菌耐药性发展的动态影响，确定导致耐药性产生的临界暴露条件。
评估耐药性变化的稳定性，观察在无消毒剂压力下连续传代后，细菌的耐药性表型是否能够稳定遗传，还是会逐渐恢复到原始状态。
研究耐药菌株在实际食品基质（如肉类、乳制品、即食食品）中的存活能力、毒力基因表达和致病性变化，分析其对食品安全和公共健康的潜在风险。
开发能够有效杀灭生物膜细菌且不易诱导耐药性的新型消毒技术，如复合消毒剂、纳米消毒剂、光动力消毒、冷等离子体消毒等，评估其对耐药菌的杀灭效果。
开展食品加工环境现场调查，分离实际存在的生物膜菌株，测定其消毒剂耐受性和抗生素耐药性，验证实验室研究结果在实际环境中的适用性。
研究消毒剂与抗生素联合使用对生物膜细菌的作用效果，筛选具有协同杀菌作用且能抑制耐药性产生的组合方案。
7. 测量的数据及其研究意义
五种消毒剂对四株单菌和两种混合菌的MIC和MBC数据，数据来自表1。该数据明确了不同消毒剂对受试菌株的基础抗菌活性，发现李斯特菌对PAA的敏感性低于沙门氏菌，而对SHY和BZK的敏感性高于沙门氏菌；混合生物膜的MIC值通常介于两种单菌之间，为后续生物膜实验中使用MIC/2的亚抑制浓度提供了准确依据。
暴露于不同消毒剂后，单核细胞增生李斯特菌LM30单种和混合生物膜细胞对10种抗生素的MIC和MBC数据，数据来自表2。该数据显示LM30在混合生物膜中暴露于BAPA后对四环素和红霉素从敏感转为耐药，而在两种生物膜中暴露于SHY和BAPA后对恩诺沙星从耐药转为敏感，揭示了生物膜类型和消毒剂种类对耐药性变化的特异性影响。
暴露于不同消毒剂后，单核细胞增生李斯特菌LM28单种和混合生物膜细胞对10种抗生素的MIC和MBC数据，数据来自表3。该数据表明LM28在单种生物膜中暴露于PVI后对四环素耐药，在混合生物膜中暴露于SHY和BAPA后对氨苄西林耐药，同时对氯霉素、红霉素等多种抗生素的敏感性也发生了显著变化，证实了不同菌株对消毒剂诱导耐药性的响应存在差异。
暴露于不同消毒剂后，鼠伤寒沙门氏菌ST单种和混合生物膜细胞对10种抗生素的MIC和MBC数据，数据来自表4。该数据显示ST是受消毒剂影响最大的菌株，在单种和混合生物膜中暴露于多种消毒剂后，对庆大霉素、头孢西丁、磷霉素和头孢噻吩的耐药性均显著增加，其中庆大霉素从中间耐药转为完全耐药，提示沙门氏菌可能更容易通过消毒剂暴露获得抗生素耐药性。
暴露于不同消毒剂后，肠炎沙门氏菌SE单种和混合生物膜细胞对10种抗生素的MIC和MBC数据，数据来自表5。该数据发现SE暴露于PAA后对头孢西丁从敏感转为中介，而暴露于所有五种消毒剂后对恩诺沙星从耐药转为敏感，对庆大霉素的耐药性也有所降低，进一步证实了消毒剂暴露不仅会导致耐药性增加，也可能使某些抗生素的敏感性恢复。
8. 结论
本研究证实，暴露于亚抑制浓度的过氧乙酸、苯扎氯铵、次氯酸钠、聚维酮碘和双(3-氨丙基)胺五种常用食品工业消毒剂，会显著改变单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌生物膜固着细胞的抗生素敏感性。部分菌株在消毒剂暴露后从敏感或中介耐药状态转变为完全耐药，尤其是在混合生物膜中，这种耐药性增强现象更为明显。同时，研究也观察到部分菌株对某些抗生素的敏感性显著增加的现象。这些结果表明，在食品加工环境中不当使用消毒剂（如浓度不足）会增加细菌抗生素耐药性的风险，可能导致消毒失败和临床治疗无效。因此，必须严格按照推荐浓度使用消毒剂，加强消毒过程的质量控制，避免亚致死浓度的暴露。由于自然界中细菌大多以混合生物膜形式存在，未来的研究应更多关注混合生物膜的耐药性问题，深入探究其机制并制定有效的防控措施。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C MBR微生物生长分析仪测定了五种消毒剂对四株受试菌株48小时的生长曲线，通过连续监测OD₄₂₀₋₅₈₀值的变化来确定最小抑菌浓度（MIC）。虽然论文未直接展示原始生长曲线，但该仪器的测量数据是整个研究的基础，具有以下关键研究意义：
精准客观测定MIC和MBC值：与传统的肉眼观察法相比，Bioscreen仪器能够自动、连续地每30分钟测定一次OD值，实时记录细菌的生长情况，避免了人为判断的主观性和误差。本研究中以OD₄₂₀₋₅₈₀=0.200作为生长阈值，这种定量测定方法确保了MIC值的准确性和重复性，为后续生物膜实验中使用MIC/2的亚抑制浓度提供了可靠的基础。
动态反映消毒剂的作用过程：仪器记录的完整生长曲线能够反映消毒剂对细菌生长动力学的影响，包括延迟期的延长、对数期生长速率的降低以及最大生长量的减少。这些信息比单一的终点MIC值更能深入揭示不同消毒剂的作用机制，例如氧化性消毒剂通常会快速抑制细菌生长，而阳离子表面活性剂可能会有更长的延迟期。
高通量测定提升实验效率：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定多个样品的生长曲线。本研究中需要测定5种消毒剂、4株菌株的多个浓度梯度，以及3次生物学重复，共数百个样品。仪器的高通量特性大大提高了实验效率，缩短了实验周期，确保了所有实验能够在相同条件下完成。
标准化实验条件：仪器能够精确控制培养温度（37℃）和振荡频率，确保所有样品在完全一致的环境下生长。这排除了温度、氧气供应等环境因素对实验结果的干扰，使不同实验组之间的数据具有可比性，提高了研究结果的科学性和可信度。
数据可追溯和可重复：仪器自动记录所有时间点的OD值，并生成数字化的生长曲线，数据可以导出和长期保存。这使得实验结果具有可追溯性，其他研究人员可以根据原始数据重复实验或进行进一步分析，增强了研究的学术价值。
为生物膜耐药性研究奠定基础：准确的MIC值是确定亚抑制浓度的前提，而亚抑制浓度的选择直接影响生物膜实验的结果。Bioscreen仪器提供的精确MIC数据确保了本研究中生物膜暴露实验的科学性，使得后续观察到的抗生素耐药性变化能够可靠地归因于消毒剂的亚抑制浓度暴露。