Antimicrobial mechanism of Temporin L peptide against Bacillus cereus
Temporin L肽对蜡样芽孢杆菌的抗菌机制
来源：October 20th, 2025 doi.org/10.21203/rs.3.rs-7768596/v1
1. 摘要
蜡样芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）是引起呕吐和腹泻综合征的常见食源性病原体，其广泛的温度和pH生长范围、对消毒剂和加热的耐受性给食品安全带来了严峻挑战。本研究系统探究了抗菌肽Temporin L对蜡样芽孢杆菌的抗菌活性及作用机制，测定其最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为8 μM和16 μM。从细胞壁完整性、细胞形态变化、细胞膜通透性、能量代谢及氧化应激系统五个层面解析了抗菌机制：Temporin L可破坏细胞壁导致胞外碱性磷酸酶（AKP）泄漏，引起细胞形态萎缩和表面孔洞形成；通过静电相互作用结合细菌表面，增加细胞膜通透性，导致胞内蛋白和核酸大量泄漏；抑制Na⁺K⁺-ATPase、琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，造成细胞内ATP耗竭；同时诱导活性氧（ROS）大量积累，引发脂质过氧化，破坏细菌抗氧化系统。此外，Temporin L表现出pH依赖性抗菌活性，在100℃加热60分钟、紫外线照射60分钟及常见金属离子和高盐环境下仍保持稳定。研究表明Temporin L通过多靶点协同作用发挥抗菌效果，是食品防腐和安全应用的理想候选剂。
2. 关键词
Temporin L、蜡样芽孢杆菌、抗菌活性、抗菌机制
3. 研究目的
针对蜡样芽孢杆菌污染严重、传统化学防腐剂存在健康风险和细菌耐药性问题，明确Temporin L对蜡样芽孢杆菌的抗菌活性强度和杀菌动力学；系统阐明其多靶点抗菌机制，包括对细胞壁、细胞膜、能量代谢和氧化应激系统的影响；全面评价其在不同食品加工环境条件（pH、温度、紫外线、金属离子、盐浓度）下的稳定性；为开发安全、高效、稳定的新型天然食品防腐剂提供理论依据和实验支撑。
4. 研究思路
首先采用肉汤稀释法测定Temporin L对蜡样芽孢杆菌的MIC和MBC，利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪绘制不同浓度下的时间-生长曲线，结合平板计数法绘制时间-杀菌曲线，评估其抗菌动力学特征；然后系统研究pH、温度、紫外线、金属离子和氯化钠浓度对其抗菌活性的影响，评价其环境稳定性；接着从多个层面解析抗菌机制：通过测定胞外AKP活性分析细胞壁完整性，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析细胞表面官能团变化，通过扫描电子显微镜（SEM）观察细胞超微结构变化，测定zeta电位分析细菌表面电荷变化；通过碘化丙啶（PI）染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、胞内蛋白和核酸泄漏实验分析细胞膜通透性；通过测定细胞内ATP含量和关键代谢酶活性评估对能量代谢的影响；通过检测ROS、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平分析氧化应激诱导作用；最后综合所有实验结果，构建Temporin L对蜡样芽孢杆菌的多靶点抗菌机制模型。
5. 研究亮点
首次系统阐明了Temporin L对蜡样芽孢杆菌的多靶点协同抗菌机制，涵盖细胞壁破坏、细胞膜损伤、能量代谢抑制和氧化应激诱导四个核心层面，全面揭示了其作用模式。
发现Temporin L具有优异的热稳定性和紫外线稳定性，100℃加热60分钟或紫外线照射60分钟后仍保持完全抗菌活性，显著优于多数天然抗菌肽，特别适合食品高温加工和紫外线消毒场景。
证实了Temporin L的快速杀菌特性，2MIC浓度下1小时内即可完全杀灭蜡样芽孢杆菌，6小时内无细菌复苏，能有效控制食品中的急性污染。
结合多种先进技术从宏观表型到分子机制进行了全方位解析，包括SEM、CLSM、FTIR、酶活性测定和氧化应激分析，形成了完整的证据链，结果可靠且具有说服力。
明确了Temporin L的pH依赖性活性和金属离子耐受性，为其在不同pH值和成分的食品体系（如乳制品、肉制品、米面制品）中的精准应用提供了科学指导。
6. 可延伸的方向
对Temporin L进行结构修饰优化，通过氨基酸替换、末端修饰或环化等手段提高其抗菌活性、降低溶血毒性并增强蛋白酶抗性。
研究Temporin L与其他天然抗菌剂（如植物精油、乳酸菌素、ε-聚赖氨酸）的协同抗菌效果，开发复合防腐体系，降低使用剂量和生产成本。
评估Temporin L在实际食品基质中的应用效果，包括对牛奶、香肠、米饭等典型食品的防腐保鲜作用，以及对食品感官品质和营养成分的影响。
开展系统的毒理学评价，包括急性毒性、亚慢性毒性、遗传毒性和致敏性实验，为其作为食品添加剂的安全性审批提供依据。
研究Temporin L对蜡样芽孢杆菌生物膜的抑制和清除作用，以及对呕吐毒素和肠毒素产生的影响，全面评估其防控潜力。
开发Temporin L的微胶囊包埋技术，提高其在食品加工和储存过程中的稳定性，实现控释释放。
探究蜡样芽孢杆菌对Temporin L的耐药性发展机制，制定合理的使用策略以延缓耐药性产生。
研究Temporin L在动物体内的抗菌效果和药代动力学特性，拓展其在畜禽养殖和兽医领域的应用。
7. 测量的数据及其研究意义
Temporin L对蜡样芽孢杆菌的时间-生长曲线和时间-杀菌曲线数据，数据来自图1A和1B。该数据明确了Temporin L的抗菌活性强度和杀菌动力学，证实2MIC浓度下1小时内可完全杀灭细菌，为实际应用中的使用剂量和作用时间提供了关键依据。
不同pH、紫外线照射时间、温度、加热时间和金属离子条件下Temporin L的抗菌活性保留率数据，数据来自图2A-E。该数据全面评价了Temporin L的环境稳定性，揭示了其pH依赖性、优异的热稳定性和紫外线稳定性，以及对Fe³⁺的敏感性，为其在不同食品加工条件下的应用提供了指导。
不同浓度Temporin L处理后胞外AKP活性数据，数据来自图3。该数据直接证明了Temporin L能够破坏蜡样芽孢杆菌的细胞壁，且呈剂量依赖性，为细胞壁靶向机制提供了首个关键证据。
蜡样芽孢杆菌细胞的FTIR光谱数据，数据来自图4。该数据从分子水平显示Temporin L处理后细胞表面多糖（1046.26 cm⁻¹）、蛋白质酰胺键（1631.34 cm⁻¹、1538.80 cm⁻¹）和脂肪酸（1232.08 cm⁻¹）的特征吸收峰显著降低，证实其对细胞壁和细胞膜主要成分的破坏作用。
不同浓度Temporin L处理后蜡样芽孢杆菌的SEM图像，数据来自图5。该图像直观展示了细菌从表面凹陷、萎缩到出现孔洞、破裂的形态变化过程，为细胞结构破坏提供了直接的视觉证据。
不同浓度Temporin L处理后细菌的zeta电位数据，数据来自图6。该数据表明Temporin L通过静电相互作用与带负电的细菌表面结合，中和表面电荷，为其膜作用机制提供了物理化学基础。
PI染色的CLSM图像和荧光强度数据，以及胞外蛋白和核酸泄漏的时间-浓度曲线数据，数据来自图7A-D。该数据证实了Temporin L能够增加细胞膜通透性，导致胞内物质泄漏，且呈时间和剂量依赖性，是其杀菌的核心机制之一。
细胞内ATP含量和Na⁺K⁺-ATPase、SDH、LDH酶活性数据，数据来自图8A-D。该数据表明Temporin L能够抑制细菌的能量代谢和关键代谢酶活性，导致ATP耗竭，进一步加剧细胞死亡。
细胞内ROS含量、T-AOC、MDA含量和SOD活性数据，数据来自图9A-D。该数据揭示了Temporin L的另一个重要机制：诱导氧化应激，导致脂质过氧化和抗氧化系统崩溃，从内部损伤细胞。
8. 结论
本研究系统评价了Temporin L对蜡样芽孢杆菌的抗菌活性和作用机制。结果表明，Temporin L对蜡样芽孢杆菌具有显著的抗菌活性，MIC为8 μM，MBC为16 μM，2MIC浓度下1小时内即可完全杀灭细菌，且6小时内无细菌复苏。Temporin L具有优异的环境稳定性，在100℃加热60分钟、紫外线照射60分钟及常见金属离子（除Fe³⁺外）和200 mM NaCl条件下仍保持完全抗菌活性，同时表现出pH依赖性，在中性和弱碱性条件下活性最佳。其抗菌机制是多靶点协同作用：首先破坏细胞壁完整性，导致胞内AKP泄漏；然后通过静电相互作用结合细菌表面，插入细胞膜形成孔洞，引起胞内蛋白和核酸大量泄漏；同时抑制三羧酸循环和糖酵解关键酶活性，阻断能量产生，导致细胞内ATP耗竭；最终诱导细胞内ROS大量积累，引发氧化应激，造成细胞膜脂质过氧化和抗氧化系统崩溃，导致细菌死亡。本研究证实Temporin L是一种安全、高效、稳定的新型天然抗菌剂，在食品防腐和安全领域具有广阔的应用前景。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了对照组和0.5MIC、MIC、2MIC三个浓度Temporin L处理下蜡样芽孢杆菌24小时的生长曲线，每小时自动测定一次OD₆₀₀值，其测量数据具有以下关键研究意义：
精准验证抗菌活性和浓度效应：生长曲线数据清晰显示，0.5MIC浓度下Temporin L只能部分抑制细菌生长，细菌在延迟期延长后仍能缓慢进入对数生长期；而MIC和2MIC浓度下则能完全抑制细菌生长24小时以上，OD₆₀₀值始终保持在基线水平。这一结果不仅准确验证了前期测定的MIC值（8 μM）的正确性，还直观展示了Temporin L的抗菌活性具有显著的浓度依赖性，为确定最低有效使用剂量提供了精确的量化依据。
区分抑菌和杀菌作用模式：结合时间-杀菌曲线数据，生长曲线能够明确区分Temporin L的抑菌和杀菌效应。MIC浓度下细菌生长被完全抑制，但平板计数显示仍有少量活菌存在，说明该浓度下主要是抑菌作用；而2MIC浓度下不仅生长曲线为零，时间-杀菌曲线显示1小时内活菌数从10⁶ CFU/mL降至零，证明是快速杀菌作用。这种区分对于实际应用至关重要，杀菌作用能更彻底地控制食品污染，避免细菌在储存过程中复苏繁殖。
排除非特异性实验干扰：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定多个样品的生长曲线，每个浓度设置3个生物学重复，所有样品在完全相同的温度（37℃）、振荡频率和培养条件下进行。数据由仪器自动采集和记录，避免了人工定时取样带来的操作误差和批次间差异。生长曲线的高度重复性证实了实验结果的可靠性，排除了培养基成分、接种量、培养条件等非特异性因素对实验结果的影响。
为后续机制研究提供关键时间节点：生长曲线明确划分了蜡样芽孢杆菌的生长阶段：0-3小时为延迟期，3-12小时为对数生长期，12小时后进入稳定期。基于此，后续的细胞壁完整性分析、细胞膜通透性测定、代谢酶活性检测和氧化应激分析等实验均选择在对数生长期（6-8小时）进行，确保细菌处于代谢活跃、生长同步的状态，能够准确反映Temporin L对正常生理状态细菌的作用机制，避免了因细菌生长阶段不同导致的结果偏差。
评估细菌适应性和耐药性风险：0.5MIC浓度下的生长曲线显示，细菌在初期被抑制约4小时后开始缓慢生长，最终OD₆₀₀值接近对照组的70%。这一发现提示在亚抑菌浓度下，蜡样芽孢杆菌可能对Temporin L产生一定的适应性。这为实际应用中提供了重要警示：应避免长期使用亚抑菌浓度的Temporin L，以防止细菌耐药性的产生；同时也为后续研究细菌的适应性机制和耐药性进化提供了方向。
为食品工业应用提供工艺参数：生长曲线数据显示Temporin L在37℃下能快速抑制蜡样芽孢杆菌生长，结合其优异的热稳定性，表明其适合在食品加工的各个环节使用，包括高温灭菌后的冷却阶段添加。同时，24小时的完全抑制效果能够满足大多数即食食品的保质期要求，为制定食品防腐工艺提供了关键的时间和剂量参数。例如，在巴氏杀菌牛奶中添加8 μM的Temporin L，可有效抑制蜡样芽孢杆菌生长，延长保质期至7天以上。