sRNAs Regulate Biofilm Formation via Quorum Sensing and Chemotaxis systems in Listeria monocytogenes
sRNA通过群体感应和趋化系统调控单核细胞增生李斯特菌生物膜形成
来源：C.Z. Shi et al. / Food Science and Human Wellness 16 (2027)
1. 摘要
单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）是备受关注的食源性病原体，其生物膜形成对食品安全具有重大影响。小RNA（sRNAs）在该菌的生物膜形成过程中发挥关键调控作用。本研究鉴定出3个与生物膜形成潜在相关的sRNA：ssrS、sRNA003和sRNA006，其中sRNA003和sRNA006为首次发现。研究系统探究了这3个sRNA对单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的影响及其调控机制，发现敲除这些sRNA会导致生物膜形成量减少40%，且影响生物膜形成的全过程。实时定量PCR（RT-qPCR）结果显示，与野生型相比，敲除株在不同生长阶段的群体感应和趋化系统关键基因转录水平存在显著差异。这些sRNA通过影响启动子活性，并结合群体感应和趋化系统关键基因的5'非翻译区（UTR），调控mRNA稳定性，从而在转录后水平调节生物膜形成。此外，研究还预测并验证了sRNA与靶mRNA之间的结合位点。本研究阐明了sRNA在转录后水平调控单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的通路，凸显了sRNA作为新型抗菌策略靶点的潜力，为控制该菌污染、解决食品工业中的生物膜问题提供了理论支撑。
2. 关键词
单核细胞增生李斯特菌、生物膜、小RNA、群体感应、趋化系统
3. 研究目的
针对单核细胞增生李斯特菌生物膜污染严重、防控难度大且调控机制尚未完全阐明的问题，筛选并鉴定参与生物膜形成的关键sRNA；明确ssrS、sRNA003和sRNA006对生物膜形成各阶段的影响；揭示这些sRNA通过调控群体感应和趋化系统介导生物膜形成的分子机制；验证sRNA与靶基因mRNA的相互作用及具体结合位点；构建sRNA介导的生物膜调控网络，为开发靶向sRNA的绿色抗菌技术和食品防腐策略提供理论依据和新靶点。
4. 研究思路
首先通过前期RNA-seq分析筛选出3个潜在参与单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的sRNA（ssrS、sRNA003、sRNA006），利用生物信息学方法分析其基因组定位、二级结构和进化保守性；随后利用同源重组技术构建sRNA基因敲除株和互补株，通过芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪测定各菌株在37℃和30℃下的生长动力学，排除生长差异对后续实验的干扰；采用结晶紫染色法、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察、细胞表面特性测定及生菜黏附实验，系统评估sRNA缺失对生物膜形成能力、细胞表面疏水性、自聚集能力、食品表面黏附及消毒剂抗性的影响；通过RT-qPCR分析不同对数生长阶段（早、中、晚）群体感应系统（luxS、hfq、agrB、agrC、agrD）和趋化系统（motB、cheR）关键基因的转录水平；通过mRNA半衰期测定、启动子-eGFP融合实验及电泳迁移率变动分析（EMSA），分别从转录和转录后水平阐明sRNA的调控机制；最后利用生物信息学工具预测sRNA与靶mRNA的结合位点，并通过突变体实验进行验证，最终构建sRNA介导的生物膜调控网络。
5. 研究亮点
首次在单核细胞增生李斯特菌中发现两个新型生物膜相关sRNA（sRNA003和sRNA006），丰富了该菌的非编码RNA调控网络，为生物膜调控机制研究提供了新的研究对象。
系统揭示了sRNA通过双重机制调控生物膜形成：既在转录水平影响靶基因的启动子活性，又在转录后水平通过结合靶基因5'UTR调控mRNA稳定性，完善了细菌生物膜的转录后调控理论。
证实了sRNA可同时靶向群体感应（LuxS/AI-2和Agr/AIP两大系统）和趋化系统的关键基因，通过协同调控两大通路影响生物膜形成的全过程，为理解细菌复杂的调控网络提供了新视角。
明确了sRNA与靶mRNA结合的结构基础：三个sRNA均含有CU富集基序，且通过该基序与靶基因5'UTR结合，为后续设计靶向sRNA的反义核酸药物提供了分子基础。
发现sRNA缺失不仅降低生物膜形成能力，还显著增强了细菌对常用消毒剂苯扎溴铵的敏感性，为食品工业中生物膜的防控提供了“靶向sRNA+消毒剂”的协同增效新思路。
实验设计严谨，从生物信息学预测到表型验证，再到分子机制解析，层层递进，结合了多种前沿分子生物学技术，结果可靠且具有重要的应用价值。
6. 可延伸的方向
研究这三个sRNA在食品加工常见胁迫条件（如4℃冷藏、酸性pH、高渗透压、消毒剂处理）下的表达变化规律，评估其在实际食品生产环境中的功能和调控机制。
构建sRNA过表达株和反义RNA沉默株，进一步验证其对生物膜形成的抑制效果，开发基于sRNA的新型抗菌制剂和生物膜抑制剂。
结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，全面解析sRNA调控的全局分子网络，挖掘更多下游靶基因，完善单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的调控机制。
研究sRNA与其他已知生物膜调控因子（如SigB、c-di-AMP、SpoVG）之间的交叉调控关系，构建完整的生物膜调控网络。
利用动物感染模型和食品模拟体系，评估靶向sRNA的抗菌策略在体内和实际食品中的有效性、安全性和适用性。
探索这三个sRNA在不同血清型单核细胞增生李斯特菌及其他食源性病原体（如沙门氏菌、大肠杆菌）中的保守性和功能，开发广谱的抗菌防控技术。
开发基于sRNA的生物标志物，建立食品中单核细胞增生李斯特菌及其生物膜的快速检测方法。
研究sRNA在单核细胞增生李斯特菌毒力和宿主感染过程中的作用，评估其作为减毒疫苗靶点的潜力。
7. 测量的数据及其研究意义
sRNA的生物信息学分析数据，包括基因组定位、二级结构预测和系统发育树，数据来自图1A-C。该数据明确了三个sRNA均位于基因间区，不编码蛋白质，具有多个茎环结构且富含UC基序，在李斯特菌属中高度保守，为后续功能研究提供了重要的生物信息学依据。
野生型、sRNA敲除株和互补株在37℃和30℃下的生长曲线数据，数据来自图S3A-D。该数据证实了在37℃下sRNA缺失不影响细菌的正常生长，排除了生长差异对后续生物膜实验结果的干扰；同时发现30℃下敲除株对数生长期有短暂延迟，提示sRNA可能参与细菌对低温环境的适应。
不同时间点（12-72h）生物膜形成的结晶紫染色定量数据，数据来自图2A。该数据定量显示sRNA敲除株的生物膜形成量较野生型减少约40%，且在生物膜形成的各个阶段均有显著差异，直接证明了sRNA在生物膜形成中的关键作用。
生物膜的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，数据来自图2B。该图像直观展示了敲除株生物膜结构稀疏、死细胞比例增加的表型，为生物膜形成减少提供了形态学证据。
细胞表面疏水性和自聚集能力测定数据，数据来自图2C。该数据表明sRNA缺失显著降低了细菌的细胞表面疏水性和自聚集能力，解释了生物膜初始黏附阶段受损的原因。
生菜表面黏附及消毒剂抗性实验数据，数据来自图2D。该数据证实sRNA敲除株在食品表面的黏附能力下降，且对苯扎溴铵更敏感，为食品工业中生物膜的防控提供了应用方向。
早、中、晚对数生长期群体感应和趋化系统关键基因的转录水平数据，数据来自图3A-C。该数据揭示了sRNA对靶基因的转录调控具有生长阶段依赖性，为阐明其调控机制提供了转录水平的证据。
靶基因mRNA的半衰期数据及降解曲线，数据来自表1和图S6。该数据显示sRNA缺失导致大部分靶基因mRNA半衰期缩短，而sRNA003缺失则延长了luxS和cheR的mRNA半衰期，证明了sRNA通过调控mRNA稳定性在转录后水平发挥作用。
启动子-eGFP融合质粒的荧光强度测定数据，数据来自图4A-B。该数据表明sRNA缺失显著降低了靶基因的启动子活性，说明sRNA还能在转录水平通过影响启动子活性调控基因表达。
sRNA与靶基因mRNA相互作用的EMSA实验结果，数据来自图5A-C。该数据直接证实了ssrS结合agr、hfq、cheR的5'UTR，sRNA003结合luxS、cheR的5'UTR，sRNA006结合agr、mot、cheR的5'UTR，从分子水平验证了sRNA的靶基因。
sRNA与靶mRNA的结合位点预测及突变体验证数据，数据来自图6和图S7。该数据明确了sRNA通过CU富集基序与靶mRNA结合，为后续设计靶向sRNA的反义核酸提供了精确的靶点信息。
8. 结论
本研究鉴定了三个参与单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的关键sRNA：ssrS、sRNA003和sRNA006，其中sRNA003和sRNA006为首次发现。敲除这三个sRNA会导致生物膜形成量减少约40%，并影响生物膜形成的初始黏附、成熟和解离全过程，同时降低细菌的细胞表面疏水性、自聚集能力、食品表面黏附能力及消毒剂抗性。机制研究表明，这些sRNA通过双重途径调控生物膜形成：一方面在转录水平影响靶基因的启动子活性，另一方面在转录后水平通过CU富集基序结合群体感应和趋化系统关键基因的5'UTR，调控mRNA稳定性。它们同时靶向LuxS/AI-2和Agr/AIP两大群体感应系统以及趋化系统的核心基因，协同调节生物膜形成。本研究阐明了sRNA介导的单核细胞增生李斯特菌生物膜调控网络，为开发靶向sRNA的新型抗菌策略提供了重要的理论依据和潜在靶点，对控制食品工业中的生物膜污染具有重要意义。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪测定了野生型、sRNA敲除株（LM-ΔssrS、LM-ΔsRNA003、LM-ΔsRNA006）和互补株在37℃和30℃下40小时的生长曲线，每小时自动测定一次OD₆₀₀值，其测量数据具有以下关键研究意义：
核心排除生长差异对实验结果的干扰：生物膜形成能力的差异可能由细菌生长速率不同导致，而非基因功能本身。37℃下的生长曲线数据清晰显示，所有sRNA敲除株与野生型的生长曲线几乎完全重合，延迟期长度、对数期斜率和最大OD₆₀₀值均无统计学差异（P>0.05）。这一结果直接证明了sRNA缺失不影响细菌在37℃下的正常生长，后续观察到的生物膜形成减少、细胞黏附能力下降等表型确实是由sRNA功能缺失导致的，而非生长缺陷引起的，从根本上保证了所有后续实验结果的可靠性和准确性。
精准确定实验取样时间点：生长曲线明确划分了细菌的生长阶段：0-3h为延迟期，3-8h为对数生长期，8h后进入稳定期。基于此，RT-qPCR实验选择了早（4h）、中（6h）、晚（8h）三个关键的对数生长期时间点进行取样，能够准确反映sRNA在不同生长阶段对靶基因转录水平的动态调控作用，避免了因取样时间不当导致的结果偏差和假阴性。
揭示sRNA的温度依赖性功能：30℃下的生长曲线数据显示，sRNA敲除株在对数生长期（4-10h）的生长速率显著低于野生型（P<0.05），而10h后可达到野生型水平，互补株则能完全恢复生长。这一发现表明sRNA在低温条件下对细菌生长具有调控作用，提示其可能参与单核细胞增生李斯特菌对食品冷藏环境（通常为4-10℃）的适应过程，为后续研究sRNA在实际食品加工和储存条件下的功能提供了重要线索。
高通量自动化监测，提升实验效率和数据质量：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定多个菌株的生长曲线，每个菌株设置3个生物学重复，无需人工定时取样和测量，大大减少了实验误差和人力工作量。连续40小时的自动监测能够完整捕捉细菌生长的各个阶段，获得比人工测定更连续、更密集的生长动力学数据，显著提高了实验效率和数据的重复性。
标准化实验条件，保证数据可比性：仪器能够精确控制培养温度（37℃和30℃）和振荡条件，所有样品在完全相同的环境下培养，数据由仪器自动采集和记录，避免了人为操作带来的主观误差和批次间差异。本研究的生长曲线数据与后续的生物膜定量、基因表达、mRNA稳定性等实验结果相互印证，形成了完整的证据链，使不同实验间的数据具有良好的可比性和一致性。
为应用研究提供基础支撑：生长曲线数据反映了sRNA敲除株的生长特性：在37℃下生长正常但生物膜形成显著减少。这一特性使其成为潜在的减毒疫苗候选株，既能在宿主体内有限增殖诱导免疫应答，又不会导致严重疾病。同时，30℃下的生长延迟特性也为食品工业中通过“温度调控+靶向sRNA”的协同策略来防控李斯特菌污染提供了理论依据。