MoxR effects as an ATPase on anti‑stress and pathogenicity of Riemerella anatipestifer
MoxR作为ATP酶对鸭疫里默氏菌抗应激和致病性的影响
来源：Zhang et al. Veterinary Research (2025) 56:44
1. 摘要
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌（*Riemerella anatipestifer*）引起的败血症，可感染鸭、鹅、火鸡等多种家禽，在全球范围内造成严重的经济损失，但其感染和发病机制尚未完全阐明。作者前期研究发现双组分系统PhoPR与该菌致病性密切相关，通过多组学分析进一步证实PhoP可直接调控拟杆菌耐氧（Bat）操纵子中*moxR*基因的表达，而MoxR蛋白在鸭疫里默氏菌中的生物学功能此前未见报道。本研究构建了*moxR*基因敲除株（Δ*moxR*）、互补株（CΔ*moxR*）、敲低株（WT::*moxRi*）和过表达株（WT::*moxR*），系统分析了MoxR的功能。结果表明，MoxR过表达会显著抑制Bat操纵子的转录；反之，敲除*moxR*并结合热应激或氧化应激处理，会导致Bat操纵子转录水平显著升高。通过测定各菌株在应激条件下的存活能力，发现MoxR通过调控Bat操纵子的表达，在鸭疫里默氏菌的热应激和氧化应激抗性中发挥关键作用。雏鸭感染实验、鸭胚成纤维细胞（DEF）黏附和侵袭实验证实，敲除*moxR*会导致鸭疫里默氏菌致病性显著降低，各组织中的细菌载量大幅下降。本研究首次揭示了MoxR作为ATP酶在鸭疫里默氏菌抗应激和致病性中的重要作用，为阐明其致病机制提供了全新见解，也为新型减毒疫苗的开发提供了理想靶标。
2. 关键词
MoxR、鸭疫里默氏菌、应激、Bat操纵子、致病性
3. 研究目的
针对鸭疫里默氏菌血清型众多、交叉保护力差、致病机制不清的行业难题，明确MoxR蛋白的ATP酶活性及其在鸭疫里默氏菌中的核心功能；揭示MoxR对Bat操纵子的转录调控机制；阐明MoxR在鸭疫里默氏菌热应激和氧化应激适应中的作用及其分子基础；确定MoxR对细菌黏附、侵袭宿主细胞及体内定植、致病性的影响；评估*moxR*敲除株作为减毒疫苗候选株的潜力，为鸭传染性浆膜炎的防控提供新的理论依据和技术手段。
4. 研究思路
首先通过生物信息学分析MoxR的保守结构域、亚细胞定位和进化关系，原核表达并纯化His₆-MoxR融合蛋白，利用钼蓝法测定其ATP水解酶活性，验证其酶学功能；然后利用自杀质粒pRE112和穿梭质粒pRES-JX构建*moxR*基因敲除、互补、敲低和过表达菌株，通过PCR和qPCR验证菌株构建的正确性；接着通过qPCR分析不同菌株中Bat操纵子各基因的转录水平，明确MoxR对Bat操纵子的调控模式；通过热应激（42℃）和氧化应激（10 mmol/L H₂O₂）处理，测定各菌株的存活率、胞内活性氧（ROS）水平及应激条件下Bat操纵子的表达变化，阐明MoxR在抗应激中的作用；利用芬兰Bioscreen C MBR全自动生长曲线分析仪测定各菌株的生长动力学，分析MoxR对细菌增殖的影响；通过DEF细胞黏附和侵袭实验，比较野生株和Δ*moxR*的细胞黏附、侵袭能力差异；通过10日龄樱桃谷鸭感染实验，测定两株菌的半数致死量（LD₅₀）、感染后不同时间点各组织的细菌载量及雏鸭存活率，系统评估MoxR对致病性的影响；最后综合所有实验结果，阐明MoxR通过调控Bat操纵子影响鸭疫里默氏菌抗应激和致病性的分子机制。
5. 研究亮点
首次在鸭疫里默氏菌中鉴定出具有ATP酶活性的MoxR蛋白，明确了其作为Bat操纵子负调控因子的功能，填补了该菌基因调控网络的空白。
发现MoxR在抗应激中的双重调控作用：MoxR表达水平与热应激抗性呈正相关，与氧化应激抗性呈负相关，这种独特的调控模式为理解细菌应激适应机制提供了新视角。
证实了Bat操纵子在鸭疫里默氏菌氧化应激抗性中的核心作用，Δ*batA*菌株的氧化应激存活能力显著下降，为解析拟杆菌耐氧机制提供了新证据。
明确了MoxR是鸭疫里默氏菌的关键毒力因子，敲除*moxR*使菌株的LD₅₀升高约34倍，致病性显著降低，且生长缺陷适度，为开发广谱减毒疫苗提供了理想的候选靶基因。
构建了一系列*moxR*衍生菌株，为后续研究鸭疫里默氏菌的基因功能、致病机制及疫苗开发提供了重要的实验材料平台。
6. 可延伸的方向
深入研究MoxR与Bat操纵子编码蛋白的相互作用网络，通过免疫共沉淀和质谱技术鉴定MoxR的直接底物，明确其作为分子伴侣的具体作用方式。
解析MoxR蛋白的三维结构，通过定点突变技术鉴定其ATP结合、水解及调控Bat操纵子的关键氨基酸位点，揭示其结构与功能的关系。
系统评估Δ*moxR*减毒株作为疫苗的免疫原性和保护效果，包括对不同血清型鸭疫里默氏菌的交叉保护力、免疫持续期、安全性及免疫途径优化。
研究MoxR在鸭疫里默氏菌其他应激条件（如酸应激、渗透压应激、抗生素应激）中的作用，全面揭示其在细菌环境适应和耐药性中的功能。
结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，系统分析MoxR调控的全局分子网络，进一步完善其调控机制。
开发靶向MoxR的小分子抑制剂，作为新型抗菌药物用于鸭疫里默氏菌及其他相关致病菌感染的防控。
研究MoxR在脆弱拟杆菌、土拉弗朗西斯菌等其他致病菌中的功能保守性，探索其作为广谱抗菌靶标的潜力。
7. 测量的数据及其研究意义
Bat操纵子氨基酸序列保守性数据，数据来自图1。该数据表明Bat操纵子在48株不同鸭疫里默氏菌分离株中高度保守（序列相似性>93%），其中MoxR的保守性最高，说明其在该菌进化中具有不可或缺的生物学功能，为后续功能研究提供了进化依据。
MoxR的保守结构域、进化树和亚细胞定位预测数据，数据来自图2A-C。该数据明确了MoxR属于AAA+ ATP酶家族，含有Walker A、Walker B和Sensor I等保守基序，定位于细胞质，与脆弱拟杆菌的MoxR进化关系最近，为其功能预测提供了坚实的生物信息学支持。
His₆-MoxR蛋白的ATP水解酶活性数据，数据来自图2D-E。该数据直接证实了MoxR具有ATP酶活性，且水解活性随蛋白浓度和ATP浓度的升高而呈剂量依赖性增强，为其作为分子伴侣发挥功能提供了关键的酶学基础。
各衍生菌株的PCR和qPCR鉴定数据，数据来自图3A-F。该数据从基因和转录水平验证了Δ*moxR*、CΔ*moxR*、WT::*moxRi*和WT::*moxR*菌株构建的正确性，确保了后续所有实验所用菌株的基因型准确无误。
不同菌株中Bat操纵子各基因的转录水平数据，数据来自图4A-C。该数据揭示了MoxR对Bat操纵子的负调控作用：敲除*moxR*导致Bat操纵子所有基因转录显著上调，过表达则显著下调，同时证实了*moxR*与Bat操纵子其他基因位于同一多顺反子上。
各菌株在热应激和氧化应激条件下的存活率数据，数据来自图5A-C。该数据明确了MoxR在抗应激中的双重作用：MoxR表达量越高，热应激抗性越强但氧化应激抗性越弱；同时证实了BatA是鸭疫里默氏菌氧化应激抗性的关键决定因子。
应激条件下Bat操纵子的转录水平数据，数据来自图5D-E。该数据表明热应激和氧化应激均能诱导Bat操纵子的表达上调，且这种上调依赖于MoxR的调控，进一步支持了MoxR在细菌应激适应中的核心地位。
各菌株胞内ROS水平数据，数据来自图5F。该数据从分子水平解释了氧化应激抗性差异的原因：Δ*moxR*的胞内ROS水平显著低于野生株，而CΔ*moxR*则更高，说明MoxR通过调控Bat操纵子影响细菌的氧化还原稳态。
野生株、Δ*moxR*、CΔ*moxR*、WT::*moxRi*和WT::*moxR*的生长曲线数据，数据来自图6。该数据表明MoxR是鸭疫里默氏菌正常生长增殖所必需的：敲除*moxR*导致生长速率显著下降，过表达则生长加快，为后续表型实验提供了重要的生长特性基础。
野生株和Δ*moxR*对DEF细胞的黏附和侵袭率数据，数据来自图7A-B。该数据表明MoxR参与调控鸭疫里默氏菌对宿主细胞的黏附和侵袭过程，敲除*moxR*导致黏附和侵袭能力分别下降约60%和70%，这是其致病性降低的重要直接原因。
野生株和Δ*moxR*感染雏鸭的存活率曲线及LD₅₀数据，数据来自图7C-D。该数据直接证实了MoxR是鸭疫里默氏菌的重要毒力因子：Δ*moxR*的LD₅₀为5.38×10⁵ CFU，比野生株（1.57×10⁴ CFU）升高约34倍，感染后雏鸭的存活率显著提高。
雏鸭感染后各组织的细菌载量数据，数据来自图7E-F。该数据表明Δ*moxR*在宿主体内的定植和增殖能力显著下降，感染后48小时野生株在心脏、肝脏、脾脏、脑和血液中的载量已超出计数范围，而Δ*moxR*仍可检测到但数量极低，进一步解释了其致病性降低的机制。
8. 结论
本研究首次在鸭疫里默氏菌中鉴定出具有ATP酶活性的MoxR蛋白，明确了其作为Bat操纵子负调控因子的核心功能。MoxR通过调控Bat操纵子的表达，在鸭疫里默氏菌的热应激和氧化应激抗性中发挥独特的双重作用。MoxR是细菌正常生长增殖所必需的，同时参与调控对宿主细胞的黏附和侵袭过程。敲除*moxR*导致鸭疫里默氏菌的致病性显著降低，雏鸭感染后的存活率大幅提高，各组织细菌载量显著下降。本研究揭示了MoxR在鸭疫里默氏菌抗应激和致病性中的重要作用，为阐明其致病机制提供了全新见解，同时为开发安全、有效的新型减毒疫苗和抗菌药物提供了理想的分子靶标。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C MBR全自动生长曲线分析仪测定了野生型（WT）、Δ*moxR*、CΔ*moxR*、WT::*moxRi*和WT::*moxR*共5株菌在37℃条件下40小时的生长曲线，每30分钟自动测定一次OD₆₀₀值，其测量数据具有以下关键研究意义：
直接证实MoxR对细菌增殖的核心作用：生长曲线数据清晰显示，与野生株相比，Δ*moxR*的延迟期延长约2小时，对数期生长速率下降约30%，最大OD₆₀₀值降低约25%；而WT::*moxR*的生长速率显著加快，最大OD₆₀₀值升高约15%；CΔ*moxR*的生长速率部分恢复但未达到野生株水平，WT::*moxRi*的生长速率则低于野生株。这一结果直接证明了MoxR是鸭疫里默氏菌正常生长增殖所必需的关键基因，其表达水平与细菌增殖能力呈正相关。
排除生长差异对后续实验结果的干扰：通过定量分析各菌株的生长动力学参数（延迟期长度、对数期斜率、最大OD值），明确了不同菌株的生长特性差异。在后续的应激实验、黏附侵袭实验和致病性实验中，所有菌株均调整至相同的OD₆₀₀值（1.0）进行处理，确保初始菌量和生长阶段一致，排除了“细菌生长速率不同导致表型差异”的干扰，保证了实验结果的可靠性和准确性。
高通量自动化监测，提高实验效率和数据质量：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定5个菌株各3个生物学重复的生长曲线，无需人工定时取样和测量，大大减少了实验误差和工作量。40小时的连续自动监测能够完整捕捉细菌生长的各个阶段（延迟期、对数期、稳定期），获得比人工测定更连续、更密集的生长动力学数据，显著提高了实验效率和数据的重复性。
标准化实验条件，保证数据可比性：仪器能够精确控制培养温度（37℃）和振荡条件，所有样品在完全相同的环境下培养，数据由仪器自动采集和记录，避免了人为操作带来的主观误差和批次间差异。本研究的生长曲线数据与后续的应激实验、致病性实验结果相互印证，形成了完整的证据链，使不同实验间的数据具有良好的可比性和一致性。
为减毒疫苗的开发提供关键依据：Δ*moxR*菌株的生长速率显著降低但仍能正常生长，这一特性使其成为理想的减毒疫苗候选株：既能够在宿主体内有限增殖以诱导有效的免疫应答，又不会导致严重的疾病。生长曲线数据为后续疫苗株的培养条件优化、发酵工艺开发、免疫剂量确定及免疫程序制定提供了重要的实验依据。
支持MoxR的分子伴侣功能假说：MoxR作为AAA+ ATP酶家族的成员，其典型功能是作为分子伴侣参与蛋白质的折叠和组装。生长曲线数据显示，敲除*moxR*导致细菌出现明显的生长缺陷，这与分子伴侣功能缺失导致的蛋白质错误折叠、功能障碍及代谢紊乱一致，为MoxR的分子伴侣功能假说提供了有力的表型证据，也为后续研究其具体底物和作用机制奠定了基础。