Antibacterial Efficacy of Ethanol Extracts from Edible Rumex madaio Root and Application Potential for Eliminating Staphylococcus aureus and Vibrio cholerae in Aquatic Products for Green Food Preservation
食用羊蹄根乙醇提取物的抗菌功效及在水产品中消除金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌以实现绿色食品保存的潜力
来源：Foods 2025, 14, 3479.
1. 摘要
食用药用植物是挖掘下一代绿色食品防腐剂的天然植物化学宝库。本研究评估了食用羊蹄（*Rumex madaio*）根茎55-95%乙醇提取物（RmEEs）的抗菌活性，其中75%乙醇提取物表现出最强的抗菌活性，其纯化组分2（RmEE-F2）对常见致病菌金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）和霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）的增殖具有阻断作用，最低抑菌浓度（MIC）均为391 µg/mL。1×MIC浓度的RmEE-F2可改变细菌细胞表面生物物理参数并破坏细胞结构，导致胞内核酸和蛋白质泄漏。在4℃冷藏24小时条件下，RmEE-F2对人工污染鲫鱼（*Carassius auratus*）和南美白对虾（*Penaeus vannamei*）中的金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的抑菌率达88.21-91.17%。同时，RmEE-F2能有效抑制4℃冷藏6天期间鲫鱼和南美白对虾肉样的pH上升、脂质氧化和蛋白质降解。此外，浓度低于781 µg/mL的RmEE-F2对人结肠Caco-2、肝脏HepG-2和肺A549细胞系无细胞毒性，且能使感染霍乱弧菌和金黄色葡萄球菌的Caco-2细胞存活率提高14.31-16.60%（1×MIC）。比较转录组分析显示，RmEE-F2可下调受试细菌的蛋白质合成、细胞壁和细胞膜合成以及DNA复制和修复相关基因。RmEE-F2中的主要抗菌化合物包括蜜二糖（9.86%）、3-(N,N-二甲基氨基甲基)吲哚（7.12%）和柠檬酸（6.07%）。总体而言，本研究强调了RmEE-F2在水产品绿色保鲜方面的广阔应用前景。
2. 关键词
羊蹄、抗菌活性、抗菌机制、绿色食品保鲜、天然产物、食品安全
3. 研究目的
针对抗生素滥用导致的细菌耐药性危机以及传统化学防腐剂的健康风险，开发安全、高效的天然绿色食品防腐剂；比较不同浓度乙醇（55%、75%、95%）提取羊蹄根中抗菌成分的效率，筛选最优提取工艺；分离纯化75%乙醇提取物中的活性组分，分析其对水产品常见致病菌金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的抗菌活性及作用模式；从细胞和分子水平阐明活性组分的抗菌机制；评估其在低温冷藏条件下对人工污染水产品中致病菌的消除效果及对水产品品质的保鲜作用；通过体外细胞实验评价其生物安全性，为其在食品工业中的应用提供科学依据。
4. 研究思路
首先采集新鲜羊蹄根，经冷冻干燥、粉碎后，分别用55%、75%和95%乙醇进行浸提和超声辅助提取，通过旋转蒸发浓缩得到粗提物；采用纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定不同提取物对9种常见致病菌的抑菌圈直径（DIZ）和MIC值，筛选出抗菌活性最强的75%乙醇提取物；利用制备型高效液相色谱（Pre-HPLC）对75%乙醇提取物进行分离纯化，得到三个组分，通过抗菌活性测定筛选出最优组分RmEE-F2；通过芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪绘制细菌生长曲线，结合平板计数法测定时间杀菌曲线，评估RmEE-F2的抑菌动力学；通过测定细胞表面疏水性（CSH）、细胞膜流动性（CMF）、内膜通透性（ICMP）、核酸和蛋白质泄漏量以及扫描电子显微镜（SEM）观察，分析RmEE-F2对细菌细胞膜结构和功能的影响；利用Illumina RNA测序技术进行比较转录组分析，从分子水平揭示抗菌机制，并通过RT-qPCR验证关键差异基因的表达；在人工污染金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的鲫鱼和南美白对虾样品中，测定不同冷藏时间的活菌数和抑菌率，评估实际抗菌效果；通过测定pH、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、总挥发性盐基氮（TVB-N）和感官评价，分析RmEE-F2对水产品品质的保鲜作用；采用CCK-8法测定RmEE-F2对人Caco-2、A549和HepG-2细胞的毒性，并建立Caco-2细胞感染模型，评估其对感染细胞的保护作用；最后通过超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）技术鉴定RmEE-F2中的主要化学成分，明确潜在抗菌物质。
5. 研究亮点
首次系统研究了食用羊蹄根乙醇提取物的抗菌活性，证实其对水产品中高风险致病菌金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌具有显著抑制作用，且75%乙醇为最优提取溶剂，提取率达33.8%。
分离得到的纯化组分RmEE-F2具有广谱抗菌潜力，对7种受试致病菌均有抑制作用，且对金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的MIC均为391 µg/mL，在实际水产品中的使用剂量（0.0391 g/kg）远低于尼生素、茶多酚和山梨酸等现有食品防腐剂。
从细胞和分子水平系统阐明了RmEE-F2的多靶点抗菌机制：通过降低细胞表面疏水性、增加细胞膜流动性和通透性，破坏细胞膜完整性，导致胞内物质泄漏；同时抑制金黄色葡萄球菌的蛋白质合成和β-内酰胺耐药性，阻断霍乱弧菌的DNA复制与修复、细胞壁和细胞膜合成。
证实RmEE-F2在4℃低温冷藏条件下能有效消除水产品中的致病菌，抑菌率达88.21-91.17%，同时显著延缓脂质氧化和蛋白质降解，将鲫鱼和南美白对虾的保质期延长至少2天，且对产品感官品质无不良影响。
生物安全性优异，在781 µg/mL浓度下对人体三种细胞系无明显毒性，且能有效保护Caco-2细胞免受致病菌感染，为其作为食品防腐剂的安全应用提供了保障。
鉴定出蜜二糖、3-(N,N-二甲基氨基甲基)吲哚和柠檬酸等主要潜在抗菌成分，为后续单一成分的分离和活性优化奠定了基础。
6. 可延伸的方向
进一步分离纯化RmEE-F2中的单一抗菌成分，研究各成分的单独抗菌活性及相互间的协同作用，明确核心抗菌物质。
优化羊蹄根的提取和纯化工艺，采用响应面法、超声-微波协同提取等技术提高抗菌成分的得率和纯度，降低生产成本。
扩大研究范围，评估RmEE-F2对更多食品腐败菌和致病菌（如副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌）的抗菌效果，以及在肉类、乳制品、果蔬等其他食品基质中的保鲜应用。
开展动物体内实验，验证RmEE-F2在体内的抗菌活性、代谢动力学和长期食用安全性，为其申报食品添加剂提供毒理学数据。
开发基于RmEE-F2的复合保鲜体系，与ε-聚赖氨酸、壳聚糖、植物精油等天然防腐剂或气调包装、低温等离子体等物理保鲜技术结合，实现协同增效。
利用分子对接、表面等离子体共振等技术，研究RmEE-F2中主要抗菌成分与细菌靶点蛋白的相互作用，从原子水平揭示其作用机制，为新型抗菌药物的设计提供思路。
研究RmEE-F2在食品加工和储存过程中的稳定性，如温度、pH、光照对其抗菌活性的影响，开发相应的包埋技术提高其稳定性。
7. 测量的数据及其研究意义
不同浓度乙醇提取物的抑菌圈直径（DIZ）和最低抑菌浓度（MIC）数据，数据来自表S1。该数据明确了75%乙醇为提取羊蹄根抗菌成分的最优溶剂，其对金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的DIZ分别为17.00±0.50 mm和11.50±0.32 mm，MIC分别为98 µg/mL和391 µg/mL，为后续纯化研究提供了基础。
Pre-HPLC纯化图谱及各纯化组分的DIZ和MIC数据，数据来自图1A和表S2。该数据显示75%乙醇提取物可分离为三个组分，其中组分2（RmEE-F2）的抗菌活性最强，对金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的MIC均为391 µg/mL，确定了后续机制研究的目标组分。
金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌在不同浓度RmEE-F2处理下的生长曲线和时间杀菌曲线数据，数据来自图1B-E。该数据定量展示了RmEE-F2对两种细菌生长的浓度依赖性抑制作用，1×MIC浓度下24小时内可使金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的活菌数分别降低5.93 Log CFU/mL和3.90 Log CFU/mL，证实了其强效杀菌效果。
细菌细胞表面疏水性（CSH）、细胞膜流动性（CMF）和内膜通透性（ICMP）随处理时间变化的数据，数据来自图2A-D。该数据揭示了RmEE-F2对细菌细胞膜的作用：处理6小时后，金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的CSH分别降低2.47倍和9.17倍，CMF分别增加3.71倍和1.14倍，ICMP显著升高，表明细胞膜结构和功能受到严重破坏。
细菌胞外核酸（OD260）和蛋白质含量随处理时间变化的数据，数据来自图2E-F。该数据证实了细胞膜完整性的丧失，处理6小时后，金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的胞外核酸量分别增加1.24倍和2.05倍，24小时后胞外蛋白质含量分别增加1.43倍和1.71倍，进一步支持了细胞膜损伤的抗菌机制。
金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌在RmEE-F2处理不同时间后的扫描电子显微镜（SEM）图像，数据来自图3。该图像直观展示了细菌细胞形态的变化：处理2小时后细胞表面出现凹陷和褶皱，4小时后损伤加剧，6小时后细胞破裂、内容物外泄，为细胞膜损伤机制提供了直接的形态学证据。
转录组学差异基因火山图和富集代谢通路数据，数据来自图4和表S3、S4。该数据从分子水平揭示了RmEE-F2的抗菌机制：在金黄色葡萄球菌中，389个基因显著下调，主要富集于核糖体、氨基酸生物合成和β-内酰胺耐药通路；在霍乱弧菌中，2213个基因显著下调，主要富集于DNA复制、错配修复、肽聚糖生物合成和脂肪酸生物合成通路。
人工污染鲫鱼和南美白对虾中金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌的活菌数及抑菌率数据，数据来自图5。该数据验证了RmEE-F2在实际食品基质中的抗菌效果，4℃冷藏24小时后，对鲫鱼中两种细菌的抑菌率分别为91.17%和89.65%，对南美白对虾中两种细菌的抑菌率分别为88.21%和90.01%，与阳性对照抗生素效果相当。
鲫鱼和南美白对虾在冷藏期间的pH、TBARS、TVB-N和感官评价数据，数据来自图6。该数据表明RmEE-F2能有效延缓水产品的品质劣变：冷藏8天后，处理组的pH仍低于7.0，TBARS值比对照组低32.7-36.4%，TVB-N值低于30 mg/100g的国家标准，感官评分仍在可接受范围内，证实了其良好的保鲜效果。
RmEE-F2对人Caco-2、A549和HepG-2细胞的毒性数据，数据来自图7A-C。该数据评估了RmEE-F2的生物安全性，在391 µg/mL浓度下，Caco-2和A549细胞存活率无显著变化，HepG-2细胞存活率为68.19%（弱毒性），1563 µg/mL时才表现出强毒性，确定了安全使用浓度范围。
金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌感染Caco-2细胞的存活率数据，数据来自图7D-E。该数据显示RmEE-F2能有效保护宿主细胞免受致病菌感染，使感染细胞的存活率分别提高16.60%和14.31%，进一步支持了其在食品中的应用价值。
RmEE-F2中主要化合物的UHPLC-MS鉴定结果及相对含量数据，数据来自表1和表S5。该数据明确了RmEE-F2中的主要化学成分，其中蜜二糖（9.86%）、3-(N,N-二甲基氨基甲基)吲哚（7.12%）和柠檬酸（6.07%）为含量最高的潜在抗菌物质，为后续成分研究提供了方向。
8. 结论
本研究以食用羊蹄根为原料，采用不同浓度乙醇提取抗菌成分，证实75%乙醇的提取效率最高（33.8%），其纯化组分RmEE-F2对金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌具有显著的抗菌活性，MIC均为391 µg/mL。RmEE-F2通过破坏细菌细胞膜完整性、抑制关键代谢通路发挥多靶点抗菌作用：降低细胞表面疏水性，增加细胞膜流动性和通透性，导致胞内核酸和蛋白质泄漏；在分子水平上，抑制金黄色葡萄球菌的蛋白质合成和β-内酰胺耐药性，阻断霍乱弧菌的DNA复制与修复、细胞壁和细胞膜合成。在实际应用中，RmEE-F2能有效消除4℃冷藏水产品中的致病菌，抑菌率达88.21-91.17%，同时显著延缓脂质氧化和蛋白质降解，延长水产品保质期。生物安全性实验表明，RmEE-F2在有效浓度下对人体细胞无明显毒性，且能保护感染细胞免受致病菌损伤。UHPLC-MS分析鉴定出蜜二糖、3-(N,N-二甲基氨基甲基)吲哚和柠檬酸等主要潜在抗菌成分。本研究证实了RmEE-F2作为天然绿色食品防腐剂的巨大潜力，为水产品安全保鲜提供了新的技术途径。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了金黄色葡萄球菌ATCC 25923和霍乱弧菌GIM 1.449在1/2×MIC和1×MIC浓度RmEE-F2处理下的24小时生长曲线，其测量数据具有以下关键研究意义：
连续动态监测细菌生长全过程：Bioscreen仪器每30分钟自动记录一次OD₆₀₀值，无需人工取样，能够完整捕捉细菌从延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长动力学过程。相比传统的平板计数法，避免了时间点缺失和操作误差，能够更准确地反映RmEE-F2对细菌生长的动态影响。例如，数据清晰显示1×MIC浓度的RmEE-F2能显著延长两种细菌的延迟期，降低最大生物量，而1/2×MIC浓度仅能部分抑制生长。
定量评估抗菌效果的浓度依赖性：通过生长曲线可以精确计算不同处理组的最大OD值、延迟期长度和最大生长速率等动力学参数，从而定量比较不同浓度RmEE-F2的抑菌强度。本研究中，1×MIC浓度下金黄色葡萄球菌的最大OD值从1.46降至1.03（降低0.30倍），霍乱弧菌的最大OD值降低0.37倍，明确了RmEE-F2的浓度依赖性抑菌作用。
验证MIC值的准确性：平板计数法测定的MIC值是终点结果，而生长曲线可以动态观察在MIC浓度下细菌的生长情况，验证MIC值是否能够完全抑制细菌生长。本研究中生长曲线结果与肉汤微量稀释法测定的MIC值一致，进一步证实了391 µg/mL为RmEE-F2对两种细菌的最低抑菌浓度。
高通量筛选最优抗菌条件：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定多个样品的生长曲线。本研究中同时测定了对照组、1/2×MIC组和1×MIC组共6组样品的生长曲线，大大提高了实验效率，为快速筛选最优抗菌浓度提供了技术支持。
标准化实验条件，提高数据重复性：Bioscreen仪器能够精确控制培养温度（37℃）和振荡条件，所有样品在完全相同的环境下培养，数据由仪器自动采集和导出，避免了人为操作带来的主观误差和批次间差异，提高了实验结果的重复性和可比性。
为后续机制研究提供基础：生长曲线反映了细菌的整体生长状态，结合后续的细胞膜损伤、酶活性测定和转录组学实验结果，可以更全面地阐明RmEE-F2的抗菌机制。例如，生长曲线显示细菌在处理后首先进入生长停滞期，随后细胞膜完整性被破坏，这与时间杀菌曲线和SEM观察结果一致，共同支持了细胞膜损伤的抗菌机制。
为实际应用提供剂量参考：通过不同浓度RmEE-F2的生长曲线，可以确定在食品保鲜中所需的最低有效剂量，避免过度使用带来的成本增加和安全风险，为产业化应用提供科学依据。